RNA干擾(RNA interference ,RNAi) 現象是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制。將與靶基因的轉錄產物mRNA 存在同源互補序列的雙鏈RNA(double strand RNA ,dsRNA) 導入細胞后,能特異性地降解該mRNA ,從而產生相應的功能表型缺失,這一過程屬于轉錄后基因沉默機制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范疇。RNAi 廣泛存在于生物界,從低等原核生物,到植物,真菌,無脊椎動物,甚至近來在哺乳動物中也發現了此種現象,只是機制也更為復雜。 

     早在1990 年進行轉基因植物有關研究時偶然發現,將全長或部分基因導入植物細胞后某些內源性基因不能表達,但這些基因的轉錄并無任何影響,并將這種現象稱為基因轉錄后沉默(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脈孢菌屬(Neurospora) 中發現了相似現象,只不過將這種現象命名為基因表達的阻抑作用(quelling) . 首次發現dsRNA 能夠導致基因沉默的線索來源于線蟲Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃爾大學的研究人員Guo 和Kemphues 嘗試用反義RNA 去阻斷par－1 基因的表達以探討該基因的功能,結果反義RNA 的確能夠阻斷par21基因的表達,但是奇怪的是,注入正義鏈RNA 作為對照,也同樣阻斷了基因的表達。這個奇怪的現象直到3年后才被解開——華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire 和馬薩諸塞大學癌癥中心的Craig Mello 首次將雙鏈dsRNA ——正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結果誘發了比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強得多的基因沉默。實際上每個細胞只要很少幾個分子的雙鏈RNA 已經足夠完全阻斷同源基因的表達。后來的實驗表明在線蟲中注入雙鏈RNA 不單可以阻斷整個線蟲的同源基因表達,還會導致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現象稱為RNA 干擾。

     過去認為, 哺乳動物細胞中不存在RNAi 現象,因為較長的dsRNA 在哺乳動物細胞中能誘導IFN(干擾素) 生成,并激活STAT 途徑參與的PKR(dsRNA 依賴性激酶) 的轉錄,同時dsRNA 本身與PKR 結合也能令其激活,繼而磷酸化翻譯起始因子eIF2a 使之失活,導致非特異性的蛋白質合成障礙;另一方面,dsRNA 又能誘導細胞產生多種抗病毒蛋白的2′,5′腺苷合成酶,生成   2′,5′腺苷酸,激活非特異性的RNA 酶L ,發生非特異性的RNA 降解效應。現在發現, 只要dsRNA 短于30bp ,就不會促發干擾素效應,同時又能特異性地降解mRNA ,引起基因沉默,說明dsRNA 在哺乳動物細胞中也能發揮一定作用,為以后的基因治療等RNAi 應用領域提供了新的研究方向。 

     近年來研究發現,干擾性小RNA( small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA) 是RNA 干擾作用(RNAi) 賴以發生的重要中間效應分子. siRNA 是一類長約21～25 個核苷酸( nt ) 的特殊雙鏈RNA(dsRNA) 分子,具有特征性結構,即siRNA 的序列與所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基. 此外,每條單鏈的3′端均有2～3 個突出的非配對的堿基RNAi 的主要過程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干擾性小RNA ( siRNA) ,由siRNA 介導識別并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 細胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 細胞中dsRNA 可通過多種途徑形成,如基因組中DNA 反向重復序列的轉錄產物;同時轉錄反義和正義RNA ;病毒RNA 復制中間體;以及以細胞中單鏈RNA 為模板由細胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等. 在線蟲( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把線蟲浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,還可以通過喂養表達正義和反義RNA 的細菌獲得dsRNA。

     現已初步闡明RNAi 的作用機制. RNAi 的第一步是,dsRNA 在內切核酸酶(一種具有RNase Ⅲ樣活性的核酸酶) 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正義和反義序列組成的干擾性小dsRNA ,即siRNA.果蠅中RNase III 樣核酸酶稱為Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 結合域和PAZ 結構域. 已發現在Arabidopsis , C. elegans , Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳動物中也存在Dicer 同類物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反義鏈指導形成一種核蛋白體,該核蛋白體稱為RNA 誘導的沉默復合體( RNA induced silencing complex , RISC) , 由RISC 介導切割靶mRNA 分子中與siRNA 反義鏈互補的區域,從而達到干擾基因表達作用. RISC 由多種蛋白成分組成,包括內切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 鏈搜索活性等. 線蟲C. elegans中的MUT7(一種RNase D樣蛋白) 可能是一種3′5′外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成員可能是RISC中的構成組分,如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Crassa 中的QDE; C. elegans 中的RDE1 等,以上這些蛋白與翻譯因子eIF2C 同源。 

     最新的研究進一步揭示,ATP 在siRNA 介導的RNAi 中具有重要作用. 較長dsRNA 向siRNA 的轉變要有ATP 參與. siRNA 與蛋白因子形成一個無活性的約360 kD 的蛋白PRNA 復合體;隨之, siRNA雙鏈結構解旋并形成有活性的蛋白PRNA 復合體(RISC) ,此步具有ATP 依賴性. RISC 活性復合體對靶mRNA 的識別和切割作用,這一步可能不需ATP參與。

     此外,ATP 使siRNA 5′端帶上磷酸分子,且對siRNA 的功能具有重要作用. 上述過程中siRNA 雙鏈結構解旋很可能是一種穩定的結構改變,因為siRNA 雙鏈體與細胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它輔助因子,含有siRNA 的活性復合體仍能識別和切割靶mRNA 分子。

     siRNA 可作為一種特殊引物,在RNA 依賴RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 為模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可進入上述循環. 這種過程稱為隨機降解性多聚酶鏈反應(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反復合成和降解,不斷產生新的siRNA ,從而使靶mRNA 漸進性減少,呈現基因沉默現象. RdRp 一般只對所表達的靶mRNA 發揮作用,這種在RNAi 過程中對靶mRNA 的特異性擴增作用有助于增強RNAi的特異性基因監視功能. 每個細胞只需要少量dsRNA 即能完全關閉相應基因表達,可見RNAi 過程具有生物催化反應的基本動力學特征。

     miRNA 與siRNA 的區別：

 

    RNAi 技術中的相關問題主要涉及以下幾點：

     (1) dsRNA 序列的選擇dsRNA 主要選自已知的cDNA 的開放閱讀框架(ORF) 中的基因區域。為防止mRNA 調控蛋白對RISC 與靶RNA 結合的干擾,應避免選擇包括:1) 起始密碼子下游或終止密碼的50～100 核苷酸位置以內的區域;2) 5′或3′端的非翻譯區域;3) 內含子區域。此外,序列選擇時也應避開多聚鳥苷酸序列區( ≥3 個) ,因為這樣容易形成四聚體結構, 抑制RNAi 作用。選擇與靶mRNA 上序列互補的21～23 個核苷酸長度的片段,以AA 開頭為佳,因為此法能簡化dsRNA 合成過程,降低成本,而且合成的dsRNA 能更好地抵抗RNA 酶的降解。另外,盡量使dsRNA 序列中的GC含量接近50 %(45 %～55 %最佳) ,高GC 含量能明顯降低基因沉默的效應。選擇前可以搜索BLAST數據庫,保證無其他與靶基因同源的基因存在,避免引起對其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA 均對RNAi 敏感。為確保靶基因表達的有效抑制,最好同時合成兩個或以上的針對同一基因的不同靶區域的dsRNA ;而且,標記dsRNA 正義鏈的3′端對RNAi 現象并沒有影響,現有的實驗尚未發現mRNA 的二級結構對RNAi 有任何顯著的影響。目前,RNAi 技術主要以哺乳動物細胞為對象研究其基因的功能。但> 30bp 的dsRNA 在哺乳動物細胞中會引起干擾素樣效應,導致非特異性反應。因而直接選用其下游的產物分子siRNA 來代替,達到基因研究的目的。

     (2) dsRNA 的導入方法不同的生物體可以選擇不同的方法。簡單生物,如單細胞生物等,可選用電穿孔的方法; 較復雜生物可選用dsRNA 微注射入生殖細胞或早期胚胎,線蟲也能采用腸道或假體腔注射的方法,與微注射相比,RNAi 效率上并無顯著差別。還有浸泡法、工程菌喂養法、磷酸鈣共沉淀法等。若使用的是化學法人工合成的siRNA(正義鏈和反義鏈) ,還要經過退火過程,以雙鏈的形式導入靶細胞。有人提出了以質粒或病毒為載體,通過轉導或轉染途徑,在細胞內以DNA 為模板,利用RNA 聚合酶Ⅲ,轉錄為siRNA(直接形成雙鏈或通過回文序列折疊后形成發夾結構) ,也能產生較明顯的RNAi 效應。最近,又有一種新的導入方法,就是借助高壓水槍的外力將構建的質粒直接自小鼠的尾靜脈注入體內,觀察RNAi 在活體生物模型而不是培養細胞上的基因沉默效應 ,但觀察到的siRNA 的半衰期較短,而且由于使用了高壓的外力,過程較復雜,限制了其在人類疾病治療方面的應用。而Pachuk 等則提出了肌注的方法,將針對IL－12 的siRNA 的質粒表達載體導入小鼠體內,得到的RNAi 效應更持久。

     (3) 發夾樣結構的siRNA實驗證明,發夾樣siRNA 能延長在細胞內的作用時間。此類結構可由具有回文序列的核苷酸鏈形成。但通常回文結構不易獲得,也可用頭碰頭的對稱序列來代替。轉錄發夾樣siRNA 的模板必須與載體轉錄啟動子緊密相連,而且盡可能有最短的多聚腺苷酸尾巴,這樣才能誘導高效的RNAi 效應。Paddison 等提出類似的結構也可應用于長片段dsRNA (500bp 左右) ,而不會引起RNA 非特異性的降解。這為檢測哺乳動物細胞中經過長期發育后的基因功能提供了新的途徑。

    RNAi 的應用領域及前景：RNAi 是一種高效的特異性強的基因阻斷技術,近年來發展迅速,很快就成為功能基因組研究的有力工具。通過實驗手段將dsRNA 分子導入細胞內, 特異性地降解細胞內與其序列同源的mRNA ,封閉內源性基因表達,從反向遺傳的角度研究人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應用此項技術分離了果蠅胰島素信號轉導途徑通路中的各種成分。近來也有實驗報道通過RNAi 研究細胞內脂質平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前,曾利用反義RNA 與靶mRNA 序列互補的特性來抑制其表型的發生,但由于反義RNA對內源性表達的基因抑制作用較弱,往往會產生一些過渡表型,易造成對基因功能判斷錯誤,目前已通過審批認為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物———Vitravene 。RNAi 技術與之相比,特異性更高,作用更迅速,副反應小,在有效地沉默靶基因的同時,對細胞本身的調控系統也沒有影響。最近在人類體細胞里已經成功地對近20 種基因功能進行了“敲除”,尤其是因此而了解了人類空泡蛋白Tsg101 對HIV 在人體內增殖的作用,進一步深化了對HIV 的研究。Leonid 等以脊髓灰質炎病毒為模型,利用RNAi 來誘導細胞的胞內免疫,產生抗病毒效應,尤其是針對RNA 病毒。對于易突變的病毒,可設計多種靶向病毒基因保守序列的dsRNA ,減少它對dsRNA 的抵抗。Maen 等也應用RNAi 技術成功地阻斷了MCF－7 乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關的核轉錄因子基因Sp21 的功能。RNAi 技術的應用,不僅能大大推動人類后基因組計劃(蛋白組學) 的發展,還有可能設計出RNAi 芯片,高通量地篩選藥物靶基因,逐條檢測人類基因組的表達抑制情況來明確基因的功能,并且它還將應用于基因治療、新藥開發、生物醫學研究等領域,用RNAi 技術來抑制基因的異常表達,為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟了新的途徑。