Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量測序技術原理

2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》雜志以里程碑事件報道，開創了邊合成邊測序的先河。2007年又推出了性能更優的第二代基因組測序系統——Genome Sequencer FLX System。2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列試劑和軟件，讓GS FLX的通量一下子提高了5倍，準確性和讀長也進一步提升。

GS FLX 測序原理

GS FLX系統的測序原理和GS 20一樣，也是一種依靠生物發光進行DNA序列分析的新技術；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯起來 (圖 1)。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；具有分析結果快速、準確、靈敏度高和自動化的特點。

Roche GS FLX System是一種基于焦磷酸測序原理而建立起來的高通量基因組測序系統。在測序時，使用了一種叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多萬個由光纖組成的孔，孔中載有化學發光反應所需的各種酶和底物。測序開始時，放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在各種酶的作用下，經過一個合成反應和一個化學發光反應，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時釋放出光信號。此反應釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。

圖1：GS FLX 高通量測序方法原理示意圖

測序實驗流程：
1、文庫制備：根據樣品的種類和實驗目的，將基因組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，經末端修復與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA）；

2、Emulsion  PCR：特定比例的單鏈DNA文庫被固定在特別設計的DNA捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片斷。磁珠結合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個獨特的片斷在自己的微反應器里進行獨立的擴增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。擴增后產生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增后仍結合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續的測序實驗；

3、測序反應：攜帶DNA的珠子與其他反應物混合物，隨后放入PTP板中進行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序開始。每一個與模板鏈互補的核苷酸的添加都會產生化學發光的信號，并被CCD照相機所捕獲；

4、數據分析：GS FLX系統在10小時的運行當中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息，通過GS FLX系統提供兩種不同的生物信息學工具對測序數據進行分析。

技術特點：

• 速度快，一個測序反應耗時10個小時，獲得4-6億個堿基對。比傳統的Sanger測序的方法快100倍；

• 讀長長，單個序列的讀長更長，平均可達到450個堿基左右；

• 通量高，每個反應可以得到超過100萬個序列讀長，成本大大降低；

• 準確度高，讀長超過400bp時，單一讀長的準確性可以超過99%；

• 一致性好，測序結果一致性超過99.99%；

• 可以進行Pair－End測序研究；

• 簡便高效，不需要進行建庫、克隆挑取、質粒提取等工作，一個人可以在一天內完成一個微生物物種的測序工作。

GS FLX系統的應用

自從2005年底GS 超高通量基因組測序系統問世以來，已經相繼在世界上各大測序實驗室成功落戶。這項技術的第一個“試驗品”就是來自有“DNA之父”之稱的James D Waston，他向454公司提供了自己的血液樣本。目前GS系統的用戶在Nature，Science，PNAS等世界頂級的期刊雜志上已經發表了五十多篇的學術論文。（詳細列表請查詢https://www.roche-applied-science.com/sis/sequencing/genome/index.jsp）。與GS 20系統相比較，硬件配置和軟件系統方面的革新改進，使得GS FLX系統具有了廣泛的應用：

全基因組測序

多達120 Mb的未知基因組的測序

－生成基因組結構概圖

－研究DNA序列的組織，分布和信息

－基因篩查：尋找新基因，定位和功能

－和其他基因組進行比較研究

全基因組進行從頭鳥槍法測序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆測序。

比較基因組研究

－識別單堿基突變

－識別突變熱點和保守區域

－識別插入或者缺失的基因

－斷定基因型和表型之間的相關關系（比如，研究藥物抗性的遺傳基礎）

－ 基于基因測序變化進行毒性預測

－進行流行病學分析

－了解工業生產菌株和它們的親代菌株序列上的差異作為進行工業生產菌株開發的遺傳基礎

－進行宏基因組 （metagenomics）研究

－古代化石DNA 測序研究

利用配對末端方法（Pair-End Tag）將Contigs拼接成Scaffolds。

轉錄組和基因調節研究

基于短Tags，ESTs, ChIP，或者GIS-PET序列的高通量轉錄組分析，或者miRNA 序列的基因組范圍識別，小分子和非編碼RNA的測序。

研究DNA的甲基化模式來進行基因調節的研究。

擴增產物分析

PCR產物的超精細測序（應用于醫學研究的重測序）

－在混合的腫瘤樣本中識別體細胞突變

－在群體水平上發現高可信度的SNP位點