miRNA qPCR Detection Primer Set（miRNA檢測試劑盒）實驗說明
一、概述
1、介紹
microRNA(miRNA)是一類有大約22 個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中。miRNA 在個體發育的不同時期及不同組織中有不同的表達模式，都表明了其在發育和分化中起有重大的調控作用。迄今為此，對miRNA 的檢測方法主要有Northern Blot 等基于分子雜交的方法，這些方法敏感度低、耗時長、RNA 的用量較大。miRNA Q-PCR etection Kit采用了國際上公認的核酸檢測標準技術――Real-Time PCR 技術來對miRNA 進行檢測，其具有快速、特異性強、靈敏度高等優點。
2、實驗原理
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set包含了miRNA特異的逆轉錄引物，以及qPCR正、反向引物套裝。其中莖凸環結構狀的miRNA特異逆轉錄引物可特異性的轉錄成熟的miRNA。再利用高度特異的正反向引物，使miRNA定量即靈敏又高度特異。
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set提供了一種最低能檢測到5個拷貝目標miRNA的高靈敏度的檢測方法，并且具有一個7 個數量級的動態變化范圍，反應的模板可以是總RNA或者已純化的小RNA等。
3、產品內容
|
名稱 |
介紹 |
量 |
|
RT Primer |
miRNA Reverse Transcription Primer |
2 nmol |
|
Forward Primer |
miRNA Forward Primer |
2 nmol |
|
Revers Primer |
Universal Reverse Primer |
2 nmol |
二、實驗準備
1、客戶需自己提供實驗試劑
一步法或兩步法qPCR mix，反轉錄酶，RNA 酶抑制劑，DEPC-H2O 等
2、耗材準備
無RNase，DNase 的吸頭，離心管等
3、引物準備
引物為干粉形式，需先離心，后每管加入200 μL DEPC-H2O稀
釋至10μM，混勻后于-20oC凍存備用
4、儀器準備
離心機、實時熒光定量PCR 儀等
三、實驗步驟
1．兩步法擴增
先將miRNA做反轉錄miRNA cDNA，然后再進行qPCR定量
1.1 RT Primer Mix的配置
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set可以同時檢測50個以內的miRNA分子。反轉錄之前，需預先配置RT Primer Mix(200nM)。如果需要用5S rRNA 或U6 snRNA 做內參對照，需同時配置Random Primer或內參的Reverse Prime做反轉錄引物。
1.2 逆轉錄體系
| 試劑 | 體積 | 終濃度 |
| RNA模板 | 0.2ng~1μg | 根據實驗需求 |
| RT Primer Mix | 5 μl | 20nM |
| 10×RT Buffer | 5 μl | 1× |
| RNase inhibitor | 見試劑供應商說明書 | |
| dNTP (2.5mM) | 4 μl | 200nM |
| 逆轉錄酶 | 見試劑供應商說明書 | |
| DEPC-H2O | 補足至50μl |
1.3 逆轉錄程序
反應完成后，將miRNA cDNA存放于-20℃（長期保存請分裝保
存于-80℃）。
1.4 miRNA實時定量 PCR反應體系
1.5 實時定量 PCR反應程序
2．一步法擴增：
將miRNA反轉錄和qPCR定量兩個過程放在一個管子中進行
2.1 一步法miRNA定量體系的建立
2.2 實時定量 PCR反應程序
