模式生物高通量多維表型研究方法概述
摘要：
動物個體內，多數由基因突變與生物活性分子所引發的復雜生理應答機制，無法使用細胞培養模型進行預測，而動物水平研究卻進展緩慢。本研究中，我們利用微米分辨率的高通量光學投影層析成像系統，結合高效的大顆粒流式分選系統（Union Biometrica），實現了脊椎動物的整體多維度掃描。系統以前所未有的速度與細節，在三個維度水平，自動獲取了半透明斑馬魚幼體數以百計的獨特形態特征與復雜表型。通過聚集、量化多種表型特征，我們能夠實現同時檢測、分類多個生物學進程中的精細變化。我們將這種方法稱為體內多維表型研究。為了驗證體內多維表型研究方法的巨大作用，我們利用200個獨立形態檢測參數，對數十種致畸劑（可引起軟骨形成異常）效應進行分析，結合致畸劑的已知機制，識別其相似和不同之處。
背景：
針對多種因素引起的形態學變化特征，進行高通量篩選，是現代生物學研究與藥物篩選中必不可少的。當前研究中，在細胞學水平高通量篩選（HTS）獲得的有效藥物，在進一步動物水平研究和臨床研究時，結果不盡如人意。即使是最復雜的體外模型，也無法完全展現器官形成的復雜程度與構成等信息。為了克服體外模型在藥物篩選等應用中的不足，越來越多的化學藥物使用斑馬魚(zebrafish、Danio rerio)個體進行篩選研究。斑馬魚幼體是目前廣泛應用于藥物篩選的脊椎動物模型。針對斑馬魚的大規模基因水平篩選工作已經開展了數十年，但由于所讀取的結果往往無法定量說明或局限在有限的參數記錄，因此需要更完善的解決方案。
為了將數百種表型的改變進行定量記錄分析，并實現高內涵篩選（HCS），我們應用高通量光學投影層析成像系統（high-throughput optical projection tomography system，OPT），該系統結合高效的大顆粒流式分選系統（Union Biometrica），配合特殊的圖像處理算法，能夠兼容各種顯微鏡，從而獲得微米級分辨率的3D器官或復雜形態學特征參數。這一技術幫助我們從大量動物樣本中快速獲得數百種獨特形態特征和復雜表型的信息。
Nature Communications 4, February 12, 2013, Article number:1467, doi:10.1038/ncomms2475
Carlos Pardo-Martin, Amin Allalou, Jaime Medina, Peter M. Eimon, Carolina Wählby Mehmet Fatih Yanik
1 Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology (MIT)
1 Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology (MIT)
2 Division of Health Sciences and Technology, MIT,
3 School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University
4 Centre for Image Analysis, Science for Life Laboratory, Uppsala University, Sweden.
5 Imaging Platform, Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard
6 Department of Biological Engineering, MIT
結果分析：
1.Union Biometrica BioSorter® Flow Cytometry（新式高通量分選OPT系統）：射流系統與顯微觀察系統組。BioSorte®不需要對斑馬魚樣本進行預處理，避免了常規OPT技術中最耗費時間的步驟。
2.圖像矯正過程：通過多步圖像軟件矯正，獲得準確的層析重建圖像。
3.顱面畸形三維重建與評估：每條斑馬魚幼體，記錄高達320幀的圖像，通過三維重構技術，形象化展示了斑馬魚幼體軟骨復雜表型。圖像顯示的層析效果圖充分顯示了三種不同藥物處理后的5dpf斑馬魚幼體的顱面骨骼變化。三種藥物是：retinoic acid（視黃酸）、cyclopamine（環巴胺）和flusilazole（氟硅唑）。
4.藥物篩選研究實例：不同濃度環巴胺藥物對三種軟骨生長的影響
5.體內多維度表型分析：為了全面定量斑馬魚幼體表型變異情況，研究者計算了202個獨立的指標，用于重建3D表型圖。這些參數包含了長度、3D方向、表面積及各種骨骼體積等等。
6.大量斑馬魚幼體表型變化陣列分布：每一行代表了一種藥物作用斑馬魚幼體的影響。檢測結果以顏色表示，紅色代表幼體個體表型相對未處理幼體表達下降，綠色代表表達增長。
結論：
傳統藥物高內涵篩選（HCS）技術局限在簡化的生物模型，如無線增殖的細胞系等，而在使用原代細胞、in vivo動物模型等進行HCS研究時，傳統技術面臨眾多的問題。本研究利用微米分辨率的高通量光學投影層析成像系統，結合高效的大顆粒流式分選系統（Union Biometrica），實現了脊椎動物的整體多維度掃描。本技術能夠提供脊椎動物器官和組織的3D重建圖像，針對斑馬魚幼體的研究，本技術通過能夠為研究者提供樣本個體的多種表型特征，為動物個體水平實現藥物高內涵篩選（HCS）提供了可行的技術平臺。
相關：
Union Biometrica 流式分選系統：是基于流式細胞技術開發的，與普通的流式細胞技術相比有非常很重要的特點和優勢：
COPAS VAST BioImager™ 斑馬魚自動分選系統,COPAS Platform是基于流式細胞技術開發的，但與普通的流式細胞技術相比有兩個很重要的優勢。這是市面上唯一的能夠分選20-1500um生物微粒的全自動，高通量分選系統。他的管路直徑大，可以用來分選體積較大的生物微粒，比如：線蟲、果蠅、斑馬魚、大腸桿菌、擬南芥種子。
模式生物由于其結構簡單、生活周期短、培養簡單、基因組小等特點，在生物醫學等領域發揮重要作用。模式生物作為材料不僅能回答生命科學研究中最基本的生物學問題，對人類一些疾病的治療也有借鑒意義。常見的模式生物有有真菌中的酵母，原核生物中的大腸桿菌，低等無脊椎動物中的線蟲，昆蟲綱的果蠅，魚綱的斑馬魚，植物中的擬南芥等。
這些模式生物的分選在生命科學研究中有著非常廣泛的應用，但是由于這些對象體積太大，普通流式細胞儀難以對其進行分選，而手工鏡下分選耗時耗力、效率低下、準確性難以保證，因此一種自動化大體積微粒分選系統應運而生——COPAS多參數生物微粒分析與分選系統。
Union Biometrica流式分選系統進行斑馬魚研究的文獻：
1.Presenting VAST BioImager™: A new modular, expandable platform to automate the orientation of 2-7 day old zebrafish larvae for imaging
2.Development and Validation of an Automated High-Throughput System for Zebrafish In Vivo Screenings
3.Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing
4.Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing
5.A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression
6.Zebrafish high throughput screening using robotic injection technology
7.High-throughput in vivo vertebrate screening.
8.Zebrafish High-Throughput Screening of Innate Immune Responses.
9.A High-Throughput Assay To Measure Whole Body Metabolic Rate Using Zebrafish Larvae.
10.A Whole-Animal Microplate Assay for Metabolic Rate Using Zebrafish
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