——熒光定量PCR篇——

實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料，每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段, 熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。

（一）熒光閾值和CT值

熒光閾值（threshold）是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省（默認）設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。 

CT值是指PCR擴增過程中，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。 

CT值與起始模板的關系：研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小，公式如下：Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex) 

n為擴增反應的循環次數，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。 

利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。 

（二）熒光探針和熒光染料

熒光定量檢測根據所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料。 

SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但與雙鏈 DNA 結合后，其熒光大大增強。SYBR Green I 用于qPCR無需探針，設計的程序通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點的性質，通過熔點曲線分析可以鑒定有無PCR雜帶、引物二聚體等。但是SYBR Green I 無模板特異性，因此會引起假陽性而影響定量的精確性。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對，特異性更高。

（三）qPCR注意事項

1. 用于qPCR反應的RNA應避免DNA的污染，RNA提取和反轉過程中應小心謹慎。

2. 操作過程中避光，冰上操作。

3. cDNA模板避免反復凍融，否則會引起模板的降解。

4. 模板量不足或降解將導致CT值出現過晚或者不出現。對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣品的最高濃度做起。

5. 加入模板時應先進行適度稀釋，再加入反應體系中，提高擴增效率。但模板濃度過低導致重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數。

6. 引物設計時，擴增片段不宜太長，一般在80-300bp均可；退火溫度要高，一般要在 60℃以上。并且要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。

7. 體系中引物濃度過高或者引物二聚體均會引起溶解曲線不止出現一個主峰。

8. 設置陰性對照，防止水和mix被污染。

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