Q Exactive Focus 不同高分辨定量方式在藥物分析中的應用
1. 引言
質譜技術因其出色的靈敏度和專屬性已經被廣泛的應用于藥物分析，傳統質譜定量采用單位分辨選擇離子檢測 SIM 或選擇反應監測 SRM 的定量方式，高分辨質譜具有獲得化合物離子精確質量數和分離相鄰質量峰的能力，被越來越多的應用于定量分析中。
基于 Orbitrap 靜電場軌道阱技術的 Q Exactive Focus 將高性能四極桿與高分辨 Orbitrap 技術相結合，具有高達 70,000FWHM 的分辨率和長期穩定的高質量精度，可獲得高質量的一級和二級高分辨質譜數據，保證了定性和定量結果的可靠性；媲美高端三重四極桿的靈敏度和寬線性范圍可輕松定量藥物中的微量組分。 Q Exactive Focus 提供不同的高分辨定量模式，滿足不同的定量需要：
a) 全掃描（FullScan）高分辨定量：所有掃描范圍內的化合物離子通過四極桿，送入 Orbitrap 后得到檢測，再通過精確質量數從 Fullscan 數據中提取 XIC 圖譜進行定量，因為 QExactive Focus 具有良好的質量精度，因此可以將提取窗口縮小至 5 ppm，甚至更低，充分保證了方法極高的選擇性，該種定量方式無需預知化合物信息，可以記錄所有已知和未知的化合物質譜信號，方便數據的回溯分析。
b) 選擇離子檢測（SIM）高分辨定量：通過四極桿對目標化合物進行選擇性通過，然后將目標化合物送入 Orbitrap 進行高分辨掃描，然后通過一級精確質量數提取 XIC 圖譜進行定量。該種定量方式通過高性能四極桿的篩選和過濾，可去除大量的干擾離子，使目標化合物更多的進入檢測器，提升了檢測的靈敏度。
c) 平行反應檢測（PRM）高分辨定量：通過四極桿對目標化合物進行選擇性通過，離子在通過后進入碰撞池發生高能碰撞碎裂，所產生的碎片將被同時送入 Orbitrap 進行高分辨掃描，然后選擇高分辨的二級子離子進行定量。該定量方式通過四極桿過濾掉大量干擾離子提高了靈敏度的同時，二級高分辨質譜進一步提高了定量的專屬性。
本文通過對鹽酸美金剛雜質 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行定量，分別比對了上述幾種高分辨定量方式，從原理角度對不同定量方式的特點進行闡述，對定量效果的靈敏度、線性范圍、專屬性進行了比較。
圖 1. 全掃描（FullScan）高分辨定量示意圖
圖 2. 選擇離子檢測（SIM）高分辨定量示意圖
圖 3. 平行反應檢測（PRM）高分辨定量示意圖
2. 實驗條件
2.1 液相色譜條件：
儀器： Dionex UltiMate 3000 超高效液相色譜儀
色譜柱： Thermo Scientific Hypersil Gold aQ （100×2.1 mm，1.9 µm）
流動相： A 為水相： 0.1% 甲酸水， B 為有機相：乙腈
梯度條件：
| 時間 （min） |
A | B |
| 0 | 75 | 25 |
| 5 | 60 | 40 |
| 時間 （min） |
A | B |
| 5.1 | 75 | 25 |
| 7 | 75 | 25 |
2.2 質譜條件
儀器： Thermo Q Exactive Focus 四極桿 - 靜電場軌道阱高分辨串聯質譜
離子源參數： HESI Spray voltage: +3.5 KV; Sheath Gas Pressure: 40 arb; Aux Gas Pressure: 10 arb; Capillary Temp:300℃ ; Heater Temp: 350℃
|
掃描模式 Scan Mode |
全掃描 FullScan |
選擇離子監測 SIM |
平行反應監測 PRM |
| AGC 目標值 AGC Target |
1e6 | 5e4 | 5e4 |
| 掃描范圍 Scan range |
100.00 to 700.00 m/z |
236.18 to 240.18 m/z |
50.00 to 260.00 m/z |
| 目標母離子 Target Ion |
- | 238.18016 m/z | 238.18016 m/z |
| 隔離窗口 IsolationWindow |
- | 4.0 m/z | 4.0 m/z |
| 碰撞能量 CE |
- | - | 40、60、80 |
2.3 樣品制備
取鹽酸美金剛片雜質 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品儲備液，逐級稀釋后制成含 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸 0.12、 0.6、1.2、 6.0、 12.0、 60、 120、 600、 1200、 6000、 12000 ng/ml（ppb）的溶液，分別按上述不同掃描模式進樣分析。
3. 結果
3.1 全掃描（FullScan）
全掃描 FullScan 定量記錄的是所有進入檢測器的離子信號，然后通過精確分子量提取獲得目標化合物質譜響應進而實現定量。圖 4 為 0.6、 1.2、 6.0 ng/ml 三個濃度全掃描下目標化合物的提取離子流信號，即使在 0.6 ng/ml 濃度下，上樣量僅為 0.6 pg，全掃描仍能檢測到目標化合物離子明顯的信號， 1.2 ng/ml 濃度下信號強度進一步提高，且提取離子流窗口都使用了統一的5 ppm（0.0012 amu），表明 QE Focus 在極低濃度下可以保持出色的質量精度。
考察全掃描定量的線性范圍和重現性。 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸的一級全掃描精確質量數 XIC 色譜圖， 1.2 ng/ml~12 µg/ml 標準曲線見圖 5， 1.2 ng/ml 和 120 ng/ml 兩個濃度下各 5 針精密度見圖 6。
圖 6. 全掃描定量精密度（1.2、 120 ng/ml）
結果表明， N-（二甲基金剛烷）甘氨酸在 1.2 ng/ml~12 µg/ml 線性關系良好， Y=-138720+362674X-1.44506X2， R2=1.0000，各濃度點的偏差都在 5% 以內。在 1.2 ng/ml 定量下限和 120 ng/ml 高濃度下重現性均良好， 5 針 RSD 均小于 4%
3.2 選擇離子監測（SIM）
選擇離子監測 SIM 高分辨定量通過四極桿對目標化合物進行選擇性通過，然后將目標化合物送入 Orbitrap 進行高分辨掃描。通過四極桿的篩選和過濾，可去除大量的干擾離子，使目標化合物更多的進入檢測器，然后通過一級精確質量數的提取進行定量。比較 0.12 ng/ml SIM 模式下提取離子流信號 , 結合 AGC 值和各濃度下離子注入時間 , 可知在 0.12 ng/ml 濃度下進入 Orbitrap 檢測器的目標化合物離子數目大幅增加。即使濃度比全掃描降低 10 倍，仍可獲得較好的峰型。
但在定量過程中，常存在同質異素甚至同分異構體的干擾，通過一級精確質量數無法獲得與目標化合物的有效區分，例如在 SIM 模式下各濃度 XIC，可觀察到 6.2 min 存在干擾峰（圖7 藍色虛線框部分）。
圖 7. 選擇離子監測 0.6 PPb、 1.2 PPb、 6.0 PPb 濃度下提取離子流色譜圖
從圖 8 一級質譜數據中可以看出， 6.2 min 的峰中存在m/z238.014 的干擾離子，與目標雜質 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸非常接近，僅相差 0.5 ppm，無法通過一級質譜對兩者加以區分。
圖 8. N-（二甲基金剛烷）甘氨酸和干擾峰一級質譜比對
3.3 平行反應監測（PRM）
平行反應檢測（PRM）高分辨定量通過四極桿對目標化合物進行選擇性通過，
離子在通過后立即進入碰撞池并發生高能碰撞碎裂，所產生的碎片將被同時送入 Orbitrap 進行高分辨掃描，然后選擇高分辨的二級子離子進行定量。該定量方法的特點為，在四極桿過濾掉大量干擾離子提高了靈敏度的同時，二級高分辨質譜進一步提高了定量的專屬性。
為更好的進行PRM定量，需要選擇出高質量的定量子離子，采用 Q Exactive Focus 對目標雜質 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行二級碎裂，在獲得了高質量的二級質譜圖后，將其導入專業的小分子結構解析軟件 Mass Frontier 7.0，可快速準確的完成對不同碎片離子及其所對應的結構進行自動推測（圖 9）。
圖 9. Mass Frontier 自動歸屬二級質譜碎片
該軟件含有 Fragmentation Library 碎裂數據庫，該數據庫幾乎涵蓋了所有已發表的文獻，在快速完成碎片結構歸屬的同時，可以獲得完整的碎片裂解機理，并可方便的調用查看所引用的文獻情況，保證了碎片解析的準確性（圖 10）。
圖 10. Fragmentation Library 提供碎片裂解機理
由以上分析可知， m/z 107.0855 和 163.1481 的碎片具有較高的質量，作為 PRM 定量的首選離子。
進一步，通過比對 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸二級質譜和6.2 min 干擾離子的二級質譜圖（圖 11）發現， m/z 107.0855 碎片離子同時存在于兩者之中（藍色虛線框部分），以此離子定量無法有效區分目標化合物和干擾離子，而m/z 163.1481 碎片離子只存在于目標化合物二級質譜圖中（紅色虛線框部分），以此離子定量，具有更高的專屬性。
圖 11. N-（二甲基金剛烷）甘氨酸和干擾峰二級質譜比對
通過比對 SIM 定量和 PRM 定量效果，通過采用子離子m/z 163.1481 進行 PRM 定量，可更好的去除背景干擾，獲得更高的專屬性（圖 12）。
圖 12. 不同定量方式和不同的子離子選擇情況下提取離子流比對
4. 結論：
4.1 本方法采用 Q Exacitve Focus 進行高分辨定量，獲得了出色的定量結果。全掃描定量線性范圍為 1.2 ng/ml~12 µg/ml，R2=1.000，每個濃度點和線性的偏差小于 5%，且無論是高濃度還是低濃度都獲得了小于 4% 的 RSD；選擇離子監測 SIM 通過四極桿過濾背景干擾并篩選目標母離子進行累積，可使定量靈敏度提高至 0.12 ng/ml，比進口注冊標準提高 200 倍，整個線性范圍高達 5 個數量級；平行反應監測 PRM 通過四極桿過濾背景
干擾并篩選目標母離子累積后進行高能裂解，進而獲得高質量的二級子離子全掃描信息，在保證了靈敏度的同時，有效的排除同質異素甚至同分異構的干擾，獲得更高的專屬性。
4.2 Q Exactive Focus 將高性能四極桿與高分辨 Orbitrap 技術相結合，具有高達 70,000 FWHM 的分辨率和長期穩定的高質量精度，即使在雜質極低含量的情況下，仍可獲得高質量的一級和二級高分辨質譜數據，保證了定性和定量結果的可靠性；媲美高端三重四極桿的靈敏度和寬線性范圍可輕松定量藥物中的痕量雜質。與三重四極桿質譜相比， Q Exactive Focus 采用一級質譜定量不需要優化母離子，子離子參數，僅利用目標化合物精密分子質量即可實現準確定量，更為方便快速。采用二級高分辨質譜定量可以記錄子離子全掃描信息，通過在數據后處理中靈活的挑選更具有專屬性的子離子進行定量，有效的排除基質干擾，選擇性更好，靈敏度更高。
