李靜

賽默飛世爾科技（中國）有限公司色譜質譜部

楊淑君 韓念和 薦立

上海新理念生物醫藥科技有限公司

 

Exactive Plus EMR；ADCs；cysteine -linked ADCs；Native MS

 

單克隆抗體被認為是具有高度特異性的靶向藥物，其對腫瘤細胞的靶向性非常高。而抗體- 藥物偶聯物（Antibody-drug conjugates，以下簡稱ADCs）技術，就是在抗體蛋白的特定氨基酸上偶聯具有抗腫瘤作用的高效應化療藥物（或稱小分子藥物），以增加單克隆抗體的療效、并降低小分子藥物的毒性。相比單克隆抗體，ADCs 藥物的生產工藝更為復雜，因此為了保證ADCs 藥物的安全性和有效性，需對ADCs 藥物的質量進行監控。藥物抗體比（drug to antibody ratio，以下簡稱DAR）是評價ADCs 藥物的生產工藝和產品質量的一個重要參數。目前大部分上市和在研ADCs 藥物主要包括基于抗體自身的賴氨酸進行偶聯的ADCs 藥物（lysine-linked ADCs）和基于抗體自身鏈間二硫鍵經還原后的半胱氨酸進行偶聯的ADCs 藥物（cysteine -linked ADCs）（圖1）。兩類ADCs 的DAR 測定通常有UV、HIC和MS三種方法，其中MS檢測方法因其快速、靈敏度高和強大的定性功能等優點，愈來愈廣泛地被用于測定ADCs 的DAR。目前MS 用于測定ADCs 的DAR 通常是基于傳統的RPLC/MS 平臺，該平臺下RPLC 采用的流動相呈酸性，且含有較高濃度的乙腈，蛋白在此條件下大多發生變性， 因此測定結果嚴格意義上講反映的是ADCs 變性后的DAR。對于lysine-linked ADCs 而言，上述變性條件不影響其抗體結構的完整性，故RPLC/MS 平臺不影響其DAR 測定。然而， 對于cysteine-linked ADCs 而言，上述變性條件破壞了維持抗體空間結構的非共價作用，ADCs 部分解離其輕鏈或重鏈，故RPLC/MS 平臺無法用于其DAR 測定。隨著非變性質譜（Native MS）技術的不斷發展和推廣，采用非變性質譜進行cysteine-linked ADCs 分析顯示了強大的應用潛力。

 

Thermo ScientificTM ExactiveTM Plus EMR 質譜儀保持了Orbitrap 高分辨率、高質量精度的優勢，同時擴展質量數范圍至m/z 20000，并且在硬件設計上提升高質量端離子的傳輸效率，改進了HCD 壓力，使其更加適用于完整蛋白質的分析。

 

適用于保留有三級和四級結構的非變性蛋白質和蛋白復合物的結構學、拓撲學研究以及生物制藥中非變性狀態下cysteine-linked ADCs 的分析。

 

本實驗建立了基于ExactiveTM Plus EMR 和Protein Deconvolution 3.0 軟件的非變性狀態下蛋白質的分析流程（圖2），并成功用于cysteine-linked ADCs 的分析，測定載有不同藥物分子數的ADCs混合物的精確分子量，并測定其DAR值。

圖1 Cysteine-linked ADCs 示意圖

 

圖2 非變性狀態Cysteine-linked ADCs 的分析流程

 

 

樣品PCT為Cysteine-linked ADCs，PNGase F去糖基化后，采用Micro Bio-Spin® Chromatography Columns進行緩沖溶液交換，保存于100 mM 乙酸銨（pH 7.0）中，配制成濃度為5.5 μM的溶液備用。

 

 

采用Thermo Scientific^TM Protein Deconvolution 3.0對原始質譜圖進行去卷積。

 

參數如下：

 

 

 

本實驗通過直接進樣方式，分別設置Orbitrap分辨率為17500，35000，70000， ADCs藥物的原始質譜圖如圖3，ADCs藥物的質譜峰主要分布在m/z 5000-7000范圍內，具有理想的信噪比。選取兩組質譜峰進行放大（圖4所示）可以發現，當逐漸提高質譜分辨率時，主峰逐漸與加合離子峰分離。分辨率越高，分離效果越明顯。

 

經Protein Deconvolution 3.0軟件去卷積處理之后的不同分辨率下的ADCs藥物分子質量分布如圖5所示，根據ADCs藥物單抗的氨基酸序列和小分子藥物的理論分子量進行計算，將觀察到的質譜峰進行歸屬，從圖中我們觀察到，五個主峰呈現等質量間隔（約2635Da），由此可推斷該單抗分子結合了不同數目的藥物小分子。結合cysteine-linked ADCs的特點，判斷主峰依次為結合了0、2、4、6、8個小分子藥物的ADCs混合物，該結果與理論預期一致。

 

 

圖3 不同分辨率設置下（17500，35000，70000）ADCs藥物的原始質譜圖

 

 

圖4 不同分辨率設置下（17500，35000，70000）ADCs藥物局部放大質譜圖

 

 

圖5 不同分辨率設置下（17500，35000，70000）ADCs藥物去卷積后結果

 

 

表1不同分辨率（17500，35000，70000）下去卷積后的精確分子量和質量偏差

 

不同分辨率（17500，35000，70000）下去卷積后的精確分子量如表1所示，比較發現，當分辨率設置為17500時，由于無法實現主峰和加合離子峰的有效分離，質量與理論值偏差較大，最大偏差達到7.7Da。當分辨率逐漸提升到35000，主峰逐漸與加合離子峰分離，質量偏差控制在0.3-1.6Da，具有極佳的質量準確度。當分辨率逐漸進一步提升到70000時，主峰與加合離子峰分離度進一步提高，同樣可獲得理想的質量準確度（0.2-2.7Da），滿足測定需求。

 

根據質譜峰的峰強度信息，可計算該藥物的DAR值，該數值對于ADCs藥物的有效性評估至關重要。以分辨率設置35000下質譜圖去卷積結果為例（如圖6所示），按照DAR = Σ(relative peak area×number of loaded drugs)/100計算DAR值，獲知該ADCs藥物DAR=3.9。

 

 

圖6 分辨率設置35000下質譜圖去卷積后ADCs藥物質量分布圖（D0-D8表示載有不同藥物分子數的ADCs混合物）

 

本文采用Exactive Plus EMR質譜儀，直接進樣方式，突破了傳統的RPLC/MS平臺無法進行cysteine-linked ADCs分析的瓶頸，建立了cysteine-linked ADCs的精確分子量測定方法，為cysteine-linked ADCs 單抗藥物研發和生產檢測提供了高效、快速的分析平臺。實驗結果表明Exactive Plus EMR質譜儀憑借其超高的分辨率、超快的掃描速度、超高的質量精度、超高的靈敏度以及拓展的質量范圍，極大地完善和推動了ADCs藥物的鑒定分析。

 

1. Albert J R Heck et al. Nat. Methods 2008, 5(4), 927-933.

2. Sara Rosati et al. Nature Protocols 2014,9(4) , 967-976