了解代謝組學研究的影響因素與降低生物化學和化學噪音的策略
關鍵詞
Q Exactive Focus；SIEVE 軟件；生物標記物；藥物發現；代謝組學
目的
為代謝組學生物標記物的發現開發一套全新的自動化工作流程和儀器分析方法。
前言
在制藥行業中，代謝組學用于研究潛在候選藥物的藥理學 響應所產生的生化變化，其識別毒性 / 藥效標記物的能力可以顯著加速藥物研發的進程并幫助制定合適的臨床計劃。來自于 液相色譜 - 質譜聯用技術（LC-MS）的代謝輪廓實驗數據，包含大量的化學噪音，常常干擾生物標記物的發現。本文采用全新的質譜技術和數據處理軟件來降低動物實驗中的化學背景，進而研究藥物誘導的變化與動物年齡和營養的關系。
常規 LC-MS 代謝組學研究存在很多冗余的（一種組分有多個離子）和不相關的（化學噪音）數據。同時影響代謝輪廓的外部因素（年齡、營養）增加了生物多變性。由于許多化學物質是未知的，因此，在進行結構鑒定前過濾掉假陽性結果尤 為重要。超高分辨率儀器結合超高效液相色譜（UHPLC）的分離可以提供足夠的分辨率將代謝物與化學背景區分開，解決了化學噪音和數據冗余的問題。準確質量數能確保識別相關信號所需要的精細數據處理。此技術可大大減少數據量，并改進目標代謝物的定量。生物因素對代謝輪廓有著深遠的影響，即使細小的代謝變化也會掩蓋藥物誘導的代謝效應。了解大鼠的正常代謝變化能使“生物噪音”降到最低，并提供更為可靠的藥物相關的代謝變化信息。
實驗部分
樣品前處理
抽取各組雄性大鼠（飽食，急慢性禁食，不同年齡）的 血液樣品并進行 LC-MS 分析。取 50 µL 血清樣品，加入 100 µL 含 0.1% 甲酸的冷甲醇溶液以除去蛋白質。干燥樣品，加入 200 µL10%甲醇水溶液復溶。每份樣品中加入N-苯甲�；�-D5甘氨酸（tR = 4.27 min， m/z 185.0969）作為內標。
液相色譜
采用Thermo ScientificTM Open AccelaTM 1250 UHPLC 系統 和 Thermo ScientificTM Hypersil GOLDTM aQ 色譜柱（150 × 2.1 mm, 1.9 µm粒徑）進行色譜分離。進樣量為3 µL。色譜條件如下：
質譜
采用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Focus Hybrid QuadrupoleOrbitrap 質譜儀（圖 1）分別在正離子和負離子模式下采集得到高 分辨率準確質量數（HRAM）數據，分辨率為 70,000（FWHM）。
數據處理
采用Thermo ScientificTM SIEVETM 軟件的組分提取 （Component Extraction, CE）數據處理算法分析數據，測定大鼠禁食產生的代謝效應。
結果與討論
圖 2 顯示了N- 苯甲�；�-D5- 甘氨酸內標物的高質量 LC-MS 數據。在質量軸校準后的25 到 35 小時之間采集血清 QC 重復樣的正離子模式數據，展示了 UHPLC 分析時間內優異 的峰面積和質量數測定的穩定性。基線處的色譜峰寬為 3.6 s， 每個峰獲得了 15 次掃描。 圖 3 顯示了測定內源代謝物的元素組成時分辨率為 70,000 的重要性。A+2 同位素（ m/z 313）附近的展開圖中顯 示存在一個 34S，這在 35,000 分辨率下（模擬）是不可能發現 的，因為分辨率較低時，13C2 同位素與 34S 是不能分辨的。
組分提取軟件的數據處理工作流程如圖 4 所示。該軟件能像分析人員一樣解析數據，批量處理各個數據文件，而不是單獨處理，并將每次運行得到的信息用于驗證下一次運行獲得的信息。按照這種方式，由于每種組分在數據集中的最大濃度點定義，從而大大減小了數據缺失值現象。同樣的組分在低濃度樣品中時，可以采用更靶標性的方法實現鑒定和定量。
實驗得到高度簡化的數據。數據處理去除了系統產生的大量噪音，得到了更嚴格的統計學分組和更可靠的差異分析和組分推斷結果。
表 1 中的大鼠研究實驗用于監測禁食對大鼠代謝過程的影 響。圖 5 顯示了喂養大鼠控制樣組、混合 QC 樣和禁食 4、12 和16小時血清樣主成分分析（PCA）的高質量聚類分析結果。結果清晰地顯示了喂養和禁食大鼠血清代謝組的區別，以及不 同禁食時間的代謝組差異。圖6 顯示了隨禁食時間變化增加 （Met 甲硫氨酸，20:4 FA 二十碳四烯酸）和減少（Pro 脯氨酸， 18:2 LPC 溶血磷脂酰膽堿）的代謝物。如圖6 所示，混合血 清 QC 重復樣中的每種代謝物均呈現極佳的重現性。因此，沒 有必要做技術性重復樣。圖 7 說明在實際 LC-MS 分析中，盡 管正離子和負離子模式的運行時間相隔 30 小時，血清中尿酸 的測定結果在兩種模式下仍然一致。研究證實，該 LC-MS 平臺和方法非常耐用。從而推斷生物多變性是這些數據中噪音的主要來源。
結論
Q Exactive Focus 質譜儀為非靶標代謝組學研究提供了一 種精密和耐用的平臺。此平臺擁有與 UHPLC 兼容的超快掃描速度，能在外標法校準后的相當長時間內，在正離子和負離子兩種模式下均保持優異的質量數準確度和響應值穩定性。不需 要做技術性重復樣。高達 70,000 FWHM 的分辨能力能測定精細同位素輪廓，有助于清晰地推斷元素組成。若要消除研究中 大量的噪音干擾，可以采用 SIEVE 軟件中的智能化數據簡化工具來實現化學噪音的顯著降低。此外，系統化的研究有助于生物噪音的表征，同時代謝組學預篩選功能幫助鑒定出生物離群值，從而確保整個研究的一致性。
如本研究所示，禁食是模型設計中的一個顯著變量，禁食數據有助于分析很多由藥物引起的代謝物變化。研究發現，大鼠禁食對代謝輪廓分析有著深遠的影響。雖然大多數代謝變化
在一定程度上是比較細微的，但是禁食能突顯或掩蓋掉一些藥物引起的代謝影響。
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