從表達譜至海綿機制完美進階，教你輕松玩轉環狀RNA測序加機制研究！
禽白血病病毒J亞群(ALV-J)屬于逆轉錄病毒屬，慢病毒亞科的家族成員，可引起禽類多種腫瘤性疾病，如骨髓細胞瘤、肉瘤、血管瘤、腎腫瘤和成紅細胞增多癥，以及禽類骨髓白血病，導致受感染雞的高死亡很率。該分散的ALV-J菌株分布廣泛，既能水平傳播又能垂直傳播，往往造成禽類養殖領域的巨大經濟損失。目前我們對ALV-J誘導的腫瘤發生機制仍不清楚，導致根除ALV-J帶來的損害仍然是一項重大挑戰。
近日，云序客戶華南農業大學的謝青梅研究團隊利用云序生物提供的環狀RNA測序、RIP和RNA pull down等技術手段首次揭示了感染了逆轉錄病毒ALV-J的家禽雞顯著上調的circ-Vav3通過海綿吸附gga-miR-375的作用來上調靶基因YAP1的表達，從而促進肝腫瘤的發生。該研究成果以“Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition”為題發表在《RNA Biology》（IF: 5.216）。值得注意的是，該研究團隊前期已經利用云序生物提供的環狀RNA測序服務成功發表了一篇ALV-J病毒抗性與病毒易感的雞肝臟組織當中環狀RNA表達表達譜的文章（Circular RNA alterations are involved in resistance to avian leucosis virus subgroup-J-induced tumor formation in chickens），發現了32個差異表達的環狀分子，其中12個在ALV-J抗性樣本中表達量顯著升高，而20個在易感樣本中表達量更高，而生信預測表明這些環狀RNA分子能夠調控免疫分子通路的信息傳遞從而改變生物體的免疫力。此次又與我司深入合作，利用RIP和RNA pull down技術闡明了其通過海綿吸附的調控作用來促進肝腫瘤的形成。真正實現了從環狀RNA表達譜至功能機制研究的完美進階，為其他物種或疾病類型的研究提供了不錯的參考。
該團隊先前的研究揭示gga-miR-375在禽類白血病病毒J亞群(ALV-J)感染的雞肝臟腫瘤中表達顯著下調。結合當下的研究熱點認為gga-miR-375可能與circRNA有關。在本研究中，環狀RNA測序結果顯示，在感染ALV-J的雞肝臟腫瘤中，circ-Vav3顯著上調。進一步通過RIP、生物素RNA pull down和RNA-FISH實驗證實circ-Vav3是gga-miR-375的海綿。此外，研究者通過雙熒光素酶報告基因檢測證實YAP1是gga-miR-375的靶基因，并且進一步驗證了circ-Vav3通過海綿吸附作用釋放gga-miR-375的靶基因YAP1，進而通過circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1軸影響上皮間質轉化（EMT）過程以促進腫瘤的發生，并在臨床樣本中得到了驗證。
研究內容：
1.circRNA表達譜及其結合位點預測
研究人員以ALV-J感染的雞肝為測序樣本，通過環狀RNA測序（由云序生物提供）檢測到有2822個circRNAs呈現差異性表達，其中2808個circRNAs顯著性上調。并通過聚類圖、火山圖和散點圖對25種表達上調的circRNAs進行生信分析，發現circ-Vav3上調最顯著。此外，該團隊先前的研究揭示了同樣的樣本中gga-miR-375下調最明顯。接下來利用TargetScan和miRanda軟件對25種circRNAs可能結合的miRNAs進行生信預測，結果顯示其中circ-Vav3與gga-miR-375結合的評分最高。
2.circ-Vav3海綿吸附gga-miR-375
circ-Vav3的命名主要是基于該環狀RNA來源于Vav3基因的8-11號外顯子；預測結果顯示circ-Vav3與gga-miR-375之間存在完美的靶向位點。利用海綿機制指示蛋白進行AGO2 RIP實驗（由云序生物提供），對捕獲的AGO2蛋白進行qPCR檢測發現circ-Vav3與gga-miR-375顯著富集；同時利用circ-Vav3探針進行RNA pull down實驗（由云序生物提供）檢測出了gga-miR-375的結合情況。RNA-FISH實驗證實了circ-Vav3主要存在細胞質，而gga-miR-375即存在于細胞質又存在于細胞核，揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通過相互結合發揮調控作用。
3.gga-miR-373 通過與YAP1的3’UTR區結合負調控YAP1的表達，并且過表達gga-miR-375可減弱EMT
生信預測揭示YAP1是gga-miR-375的潛在靶基因，進一步的雙熒光素酶報告基因證實了gga-miR-375可通過結合YAP1的3’UTR區抑制YAP1的表達；在體外細胞系DF-1中過表達gga-miR-375可明顯下調YAP1的mRNA和蛋白水平，揭示了gga-miR-375通過直接結合YAP1的3’UTR區，抑制YAP1基因的表達。EMT現象是腫瘤發生轉移的前兆，該過程伴隨著關鍵基因的上調（N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1）和下調（E-cadherin）。通過過表達gga-miR-375發現可以顯著上調EMT正相關的基因的mRNA和蛋白水平，下調負相關基因的mRNA和蛋白水平，并且證明了EMT相關基因并不是gga-miR-375的直接靶基因。所以gga-miR-375是通過抑制YAP1基因的表達間接抑制EMT的進程。
4.YAP1過表達促進EMT，使細胞遷移能力增強
研究者進一步通過Transwell實驗證明了過表達YAP1可顯著增強細胞的遷移能力，同時qPCR和WB也證實在YAP1過表達的DF-1細胞系中，EMT相關的關鍵基因表達情況發生了明顯的改變，說明YAP1可促進EMT的發生和細胞遷移能力。
5.circ-Vav3海綿吸附gga-miR-375上調靶基因YAP1從而促進EMT
經過前期工作的積累，研究人員認為circ-Vav3在胞漿中海綿吸附gga-miR-375，從而上調YAP1和EMT相關基因的表達。共表達實驗顯示，相對于過表達gga-miR-375和LCDH-circ-EV（空載組），而過表達gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3（實驗組）的EMT正相關基因（Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin）的蛋白和mRNA水平明顯上調，而負相關基因（E-cadherin）的蛋白和mRNA水平明顯下調；更加證實了circ-Vav3通過海綿作用吸附gga-miR-375，上調其靶基因YAP1的表達，進而誘導EMT的發生。
6.ALV-J感染細胞系和臨床樣本的驗證
利用ALV-J病毒株感染DF-1細胞系后，利用WB和qPCR技術手段進行檢測發現，細胞中circ-Vav3表達顯著上調，gga-miR-375表達顯著下調；同時，YAP1和EMT正相關基因的蛋白和mRNA水平也顯著的上調，相反的，EMT負相關基因的蛋白和mRNA水平則顯著下調。從養雞場獲取的感染ALV-J的雞的肝樣本，進行相同的檢測，得到了相同的結果，進一步夯實了整個實驗的結論。
總結：
“一站到底”！云序生物環狀RNA研究從做譜（環狀RNA測序、全轉錄組測序、環狀RNA甲基化測序）到機制研究（RNA pull down、RIP），為您全方位的覆蓋差異環狀RNA分子篩選到下游分子機制驗證的重要研究環節。此外，云序生物自行建立并維護的環狀RNA數據庫circDB憑借物種覆蓋廣、數據量大、疾病背景多的特點，支持許多客戶發表環狀RNA成果。在過去的時間里云序生物和各位生命科學領域的專家學者、醫護工作者共同進步成長，探索未知的奧秘。回首過去，從表觀遺傳學到表觀轉錄組學，從基因組到蛋白質組，從細胞內到外泌體，云序生物依托于高通量測序技術為越來越多的臨床與基礎生物研究者提供了高質量的科研服務。在我們的共同努力下，云序客戶發表越來越多的高分文章。
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https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15476286.2018.1564462?journalCode=krnb20
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