利用SC-ICP-MS 法測定單個細菌細胞中的鐵含量
優勢
ICP-MS 法可以分析成批培養的細菌細胞中的總金屬含量，然后根據測得的細胞總數平均算出單個細菌細胞的鐵含量。由于平板計數法無法計算死亡細胞或未被培養的完整細胞，導致計數出現誤差。然而，由于儀器的限制，目前還未見有方法可直接分析單個細菌細胞中的鐵含量。基于單細胞ICP-MS (SC-ICP-MS) 分析技術取得的重大進展，使得直接測定單個細胞內金屬含量成為現實。PerkinElmer 公司專利的Asperon™單細胞霧室將單個完整細胞引入ICP-MS的等離子體中，結合NexION® 系列ICP-MS 質譜儀瞬時采集速度快的優勢，可確定單個細菌細胞內的鐵含量。在本次實驗中，我們利用SC-ICP-MS 法分別測定了三種菌株的單個細胞的鐵含量。這三個菌株分別是大腸桿菌B 株(Eco)、枯草芽孢桿菌168 株(BAC) 和紅球菌RHA1 株(RHA)。SC-ICP-MS 技術可直接測定單個細胞的鐵含量，并確定每種菌株的鐵含量分布情況。鐵含量與細菌的細胞大小相關，即最大菌株(RHA)單個細胞的平均鐵含量最高，而最小菌株(Eco) 單個細胞的平均鐵含量最低。
內容簡介
對于SC-ICP-MS 分析，大腸桿菌B 株、枯草芽孢桿菌168 株和紅球菌RHA1 株均生長至具有相同的光密度，并離心至一個細菌細胞聚合體上。然后，立即將樣品冷凍、冷凍干燥并混勻。稱取制備好的樣品(10 - 30 mg) 放入Savillex® PFA 中。加入Optima® 級濃硝酸在電熱板上進行密閉消解。消解后將樣品加熱至近干，復溶于5 mL 的0.05 M HNO3 中。加拿大國家研究院的NRCC 龍蝦肝胰臟(TORT-1) 作為標準參考物質。使用純氨氣的反應模式分析56Fe。
僅用于研究。不可用于診斷。
引言
鐵是細菌細胞內部進行各種生物過程所必須的金屬輔助因子。通常，鐵作為一種可抑制細菌生長的營養元素，細胞中的總鐵含量限額取決于細胞的生長狀態和代謝需要。細菌已進化出復雜的系統來調節細胞中鐵含量。 1 細胞內多余的可溶性鐵是有毒的，這是由于過量的可溶性鐵產生會損傷細胞組分的活性氧，這意味著必須嚴格控制細胞中的鐵含量。然而，目前我們尚無法確定單個細胞內及整個細胞群內鐵含量的調節情況。在確定細胞生長條件和應激反應的影響時，包括因使用抗生素產生的應激反應，在近乎實時地測定細菌細胞中的鐵含量可提供關于細菌中鐵耐受限值的信息。有趣的是，某些具有殺菌作用的粘土礦物和粘土提取物中的可溶性鐵含量很高，這可能會破壞細菌細胞內的鐵平衡，導致細菌死亡。 2 此外，監測單個細胞內的鐵含量還可了解細胞中鐵的分布情況，從而確定細胞群的同質性。
ICP-MS 法可以分析成批培養的細菌細胞中的總金屬含量，然后根據測得的細胞總數平均算出單個細菌細胞的鐵含量。 3 由于平板計數法無法計算死亡細胞或未被培養的完整細胞，導致計數出現誤差。然而，由于儀器的限制，目前還未見有方法可直接分析單個細菌細胞中的鐵含量。
基于單細胞 ICP-MS (SC-ICP-MS) 分析技術取得的重大進展，使得直接測定單個細胞內金屬含量成為現實。 PerkinElmer 公司專利的 Asperon™單細胞霧室將單個完整細胞引入 ICP-MS的等離子體中，結合 NexION® 系列 ICP-MS 質譜儀瞬時采集速度快的優勢，可確定單個細菌細胞內的鐵含量。在本次實驗中，我們利用 SC-ICP-MS 法分別測定了三種菌株的單個細胞的鐵含量。這三個菌株分別是大腸桿菌 B 株 (Eco)、 枯草芽孢桿菌 168 株 (BAC) 和紅球菌 RHA1 株 (RHA)。 SC-ICP-MS 技術可直接測定單個細胞的鐵含量，并確定每種菌株的鐵含量分布情況。鐵含量與細菌的細胞大小相關，即最大菌株 (RHA)單個細胞的平均鐵含量最高，而最小菌株 (Eco) 單個細胞的平均鐵含量最低。
實驗
細菌培養物
本次實驗分析了三種非致病性菌株，即大腸桿菌 B 株 (Eco)，枯草芽孢桿菌 168 株 (BAC) 和紅球菌 RHA1 株 (RHA)。根據以前的文獻報道，上述菌株的細胞尺寸分別約為 2 µm、 4 µm和 10 µm ± 2。 4-6 在本次實驗中，平板分離的單克隆菌落分別接種于 3 個 5mL 的 LB 培養基試管中培養，然后在振蕩培養箱中以 200 rpm 速度， 37℃過夜培養大腸桿菌 B 株和枯草芽孢桿菌 168 株；在振蕩培養箱中以 200 rpm 速度，于 30℃過夜培養紅球菌 RHA1 株。
從每種過夜培養物中取一份等分樣本 (1 mL)，接入到已經預熱的含有 250 mL LB 培養基的燒瓶中，并將燒瓶放回振蕩培養箱中，使得菌落在上述條件下繼續生長。定期從每個燒瓶中取等分樣本 (1 mL)，使用 Cary 50 Bio 紫外可見分光光度計(Varian) 監測光密度 (OD600)。大腸桿菌 B 株和枯草芽孢桿菌168 株持續生長，直至進入后期對數生長期，最終 OD600 分別為 1.7 和 1.4。紅球菌 RHA1 株持續生長，直至進入后期穩定期，最終 OD600 為 2.3。
培養物被等分成 1 mL 樣本，并儲存在 50% 的甘油中于 -20℃保存，然后進行 SC-ICP-MS 分析。菌落密度使用平板計數法進行單位體積菌落數統計。
SC-ICP-MS 分析
將細菌細胞樣品（表 1）放入 35℃水浴中解凍 1min，然后將樣品置于冰袋，使用 1% 磷酸鹽緩沖液 (PBS) 將樣品稀釋至含有 100,000 個細胞 /mL-1 的樣品稀釋液后立即上機 SC-ICP-MS分析。樣品在使用前應單獨解凍，以防止細菌隨著時間推移而降解。 SC-ICP-MS 以 dwell time50 µs（停留時間），每個樣品分析時間 1min，重復測定三次。測試將消耗 100 µL 樣品。通過采用 ICPMS 的純氨氣通入反應池的模式（反應模式），消除ArO+ 對 56Fe+ 的干擾。 SC-ICP-MS 工作條件見表 2。
本次實驗利用濃度為 50,000 part/mL 的 NIST 60 nm (8013) 金納米顆粒標準物質，和濃度為 33,000 part/mL 的含有鑭系金屬（Ce、 Eu、 Ho 和 Lu）的 Fluidgim 2.5 µm 聚苯乙烯微球來測試方法傳輸効率 (TE)。使用濃度分別為 1、 2 和 3 ppb 的 Fe 離子標準液進行溶解離子校準。所有校準標準液的基質均與樣品基質匹配，均使用 1% PBS 制備。
ICP-MS 分析
對于 SC-ICP-MS 分析，大腸桿菌 B 株、枯草芽孢桿菌 168 株和紅球菌 RHA1 株均生長至具有相同的光密度，并離心至一個細菌細胞聚合體上。然后，立即將樣品冷凍、冷凍干燥并混勻。稱取制備好的樣品 (10 - 30 mg) 放入 Savillex® PFA 中。加入Optima® 級濃硝酸在電熱板上進行密閉消解。消解后將樣品加熱至近干，復溶于 5 mL 的 0.05 M HNO3 中。加拿大國家研究院的 NRCC 龍蝦肝胰臟 (TORT-1) 作為標準參考物質。使用純氨氣的反應模式分析 56Fe（ICP-MS 質譜儀的工作條件見表 2）。
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