Evagreen染料法數字PCR

EvaGreen®是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。作為新一代的綠色熒光核酸染料EvaGreen®，具有如下三個優勢：

1.對PCR 的抑制小，因此在實驗中EvaGreen®可使用快速PCR 溫度循環，同時可以使用較高濃度，提高亮度的同時也消除了“染料重新分布”；

2.穩定性極強，在儲存、操作和PCR過程中不會被破壞，可以反復凍融；

3.降低了細胞膜透性，更加安全。

染料法dPCR實驗反應體系含有一對用于擴增目的序列的特異區段的PCR引物和用于擴增產物使用的EvaGreen®染料。

EvaGreen®實驗的步驟如下

1.引物和擴增子設計

引物設計的原則在qPCR和digital PCR中是一樣的。具體的設計原則可以參照前面發表的引物探針設計原則。

2.實驗準備

對于任何數字PCR實驗需要準備：

數字PCR儀及專用耗材

PCR mix包含酶，dNTPs，buffer，Mg+

Evagreen

dH2O

普通PCR實驗用品：tube chip 振蕩器 離心機等。

3.反應體系

按如下反應體系配置MIX：

4.反應條件

*：根據實驗引物的Tm值來決定

5.數據采集

根據所使用的系統，數據采集將采用芯片成像的形式(Naica™系統、QuantStudio™3D數字PCR系統、CONSTELLATION®數字PCR系統……)，或者類似于流式細胞術(QX200™液滴數字PCR系統、Raindrop™數字PCR系統)，逐個讀取分區。請按照制造商的說明執行此步驟。

6.數據分析

在EvaGreen digital PCR實驗中，只有一個熒光通道需要檢查，因此數據將被表示為一維點圖。其中每個點表示一個分區，y軸表示藍色檢測通道中各分區的熒光強度，x軸表示分析軟件分配給各分區的指標編號。

6.1數據質控

根據數據采集的類型，數據分析軟件可以提供不同的質量控制。應當仔細考慮兩項標準：

NTC：NTC只用陰性微滴

總微滴數：大量的可分析分區將減少與測量濃度相關的不確定性

在Naica™系統上，還可以可視化生成的分區:

6.2閾值設置

通常，閾值是由分析軟件自動設置，閾值以上的分區為正，閾值以下的分區為負。因此，設置閾值是數字PCR對定量結果進行處理的一個強制性步驟。由于閾值設置是自動計算，我們建議您查看點一維圖。但是，下面兩種情況需要手動設置閾值：

●當有非常少的正分區或非常少的負分區時；

●當你觀察到正負分區之間有很多雨滴時。

6.3濃度計算

設置閾值后，軟件自動量化每個目標的正分區和負分區的數量。然后，使用泊松分布將這個數字讀數轉換為拷貝數。每個結果都有一個95%的置信區間，它反映了測量的精度。該方法的精度也可由“95%置信區間”值給出，越小越好!每個樣本濃度的95%置信區間及其相關的相對不確定度由分析軟件自動計算。如圖：

Evagreen數字PCR實驗具有設計簡單、條件建立快而且成本低等優點，但是 由于DNA結合Evagreen為非特異性結合雙鏈DNA，所以Evagreen方法多用于低通量、單重實驗。

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