NADP蘋果酸酶（Malic enzyme  ，NADP-ME）試劑盒-說明書

 
分光光度法 50 管/48 樣
正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：
ME 廣泛存在于微生物、培養細胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應，產生丙酮酸和 CO₂，以及伴隨 NAD(P)+的還原反應，是蘋果酸代謝的關鍵酶。ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關。近年來植物 ME 活性測定較多，已經成為抗氧化研究的熱點。根據輔酶專一性和對底物特異性的不同，可將 ME 分為 NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測定原理：
NADP-ME 催化NADP⁺還原成 NADPH，在 340nm 下測定 NADPH 增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。；
試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存； 臨用前加入 50mL 試劑一充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20
度保存，禁止反復凍融。
試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20 度保存，禁止反復凍融。
樣本的前處理：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；14000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。14000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、 分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。
2、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 850μL 試劑二，混勻，30℃孵育 5min，加入 100μL 試劑三， 混勻后立即記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1。
NADP-ME 活性計算：

1. 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

1. 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =3215×ΔA÷W

1. 按細菌或細胞密度計算：