PCR（聚合酶鏈式反應）技術是一項革命性的發明，通過PCR過程，我們可以很容易地將靶模板分子數量復制并指數放大，用于后續的研究及操作，是生命科學、農業、醫學分子診斷、檢驗檢疫的核心工具之一。

第一代PCR通過凝膠電泳（如圖一所示）對PCR產物進行終點分析以獲得樣本核酸的定性結果，只能粗略檢測核酸分子大小和含量。這種方法有三個最突出的缺點：開放式操作帶來潛在的污染風險、報告信號檢測靈敏度不足和不能準確定量。

圖一：凝膠電泳核酸定性分析

（改自：https:// bio1151.nicerweb.com）

對這三個缺點的解決，催生了第二代PCR技術qPCR（實時熒光定量PCR）技術。如圖二所示，在qPCR中，使用熒光染料或探針在封閉體系中監測每個循環后的擴增狀況，具體的定量信息通過擴增信號閾值Ct獲得。在得到Ct值后，待檢測靶標的濃度可借助于外部校準器（如標準曲線）或內源性對照估算得到相對定量結果。當前，qPCR技術已經得到了較為廣泛的應用。

圖二：qPCR核酸間接定量過程

（改自：https://www.unbc.ca/genetics/training/gene-expression）

qPCR技術本身仍然存在一些不足：由于同一反應體系內不同靶模板分子共擴增導致的競爭性抑制，起始靶模板分子數量太少使擴增信號被體系本底湮沒而導致假陰性結果，依賴標準曲線定量導致標準曲線的變動會造成定量結果的差異，抑制劑導致靶模板擴增效率降低從而影響定量準確性。另外，因為一個Ct值的差異會導致定量結果一倍的差別，所以實驗操作誤差的存在導致難以準確區分兩倍以內差異的目的靶模板分子，如單倍體與二倍體，二倍體與三倍體。這些都是qPCR固有的缺陷，很難通過優化來解決。

研究者認識到反應體系分隔、終點PCR檢測以及泊松統計的組合可以用來克服qPCR的上述不足，這種方法后來被稱為數字PCR（dPCR），即第三代PCR技術。在數字PCR中，靶模板DNA分子被分布到多個獨立微反應體系中，當微反應體系的數量足夠多時，絕大多數微反應體系中最多只有一個靶模板分子。在PCR擴增一定循環數后，含有靶模板分子的微體系產生陽性信號，而沒有靶模板分子的微體系產生陰性信號，通過對陰陽性信號計數并利用泊松分布校準就可得到靶DNA分子的絕對定量結果。近年來，皮升納升級的微液滴技術為數字PCR提供了一種實用且低成本化的實施方案，即微液滴數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）。

與qPCR技術不同，dPCR可在不借助任何外部或內源參照的情況下直接對未知樣本靶標進行檢測并定量。如圖三所示，ddPCR技術的整體操作流程可簡單地歸述為：首先將含有核酸分子的反應體系分散成成千上萬個納升級的液滴；完成液滴PCR擴增反應過程；利用流式熒光檢測或熒光成像檢測技術將液滴判別為陽性（包含靶模板分子）、陰性（不包含靶模板分子）液滴，經過熒光信號峰值提取、統計計數和泊松分布校正直接得到未知樣本中靶模板分子的濃度。通過上述流程，ddPCR技術實現對未知樣本中靶標的檢測和絕對定量。

圖三：ddPCR核酸直接定量過程

在qPCR中，樣本靶模板分子的擴增過程處于大體積反應系統中，靶模板分子的共擴增導致的競爭性抑制降低了模板分子的擴增效率，ddPCR通過將靶模板分子相互分隔在獨立的微體系中完美地解決了該問題，數量充足的微體系的相互間隔使得每個靶模板分子能夠單獨地在一個腔室中完成擴增反應，且每個腔室中的引物、探針以及反應底物也都與其他腔室相互隔離，降低了非特異性擴增的可能。

在qPCR中，存在一些特定場合例如樣本量稀少導致的起始靶模板分子數量少的情況。在這些樣本稀缺場合中，靶模板分子擴增信號易被體系本底湮沒而導致假陰性結果。而在ddPCR中，將靶模板分子分隔到相互獨立的微體系中這一過程相當于變相實現了對靶模板分子的富集，結合對微體系反應信號獨立檢測的技術手段使得對單個靶模板分子的檢測成為現實，從而使ddPCR達到單分子的檢測靈敏度。

在qPCR中，待檢樣本的起始模板量需要借助梯度稀釋的已知樣本標準曲線來定量，因此是一種需要借助標準曲線的間接、相對核酸定量方法。這種定量方法有兩個主要問題：首先，用來建立標準曲線的已知樣本的量往往通過測OD值或熒光染料定量來得到，定量結果不夠準確，而且得到的量并不能反應可擴增的模板量。其次，實驗操作誤差和系統誤差也會造成標準曲線的偏移，從而導致未知樣本的定量出現偏差。而在ddPCR中，在得到陰陽性液滴的判定結果并統計計數后，根據靶模板分子分散進入微體系符合泊松分布規律的原理對統計計數結果進行泊松分布校準就可直接得到待檢樣本起始模板量（M）的定量結果：

其中，N是總液滴數，M'是統計計數獲得的“陽性”液滴數。ddPCR直接簡潔的定量過程使得其起始模板量定量結果更精確。

在qPCR中，樣本中一些復雜基質特別是PCR抑制劑的存在，會降低靶模板擴增效率，從而影響系統拷貝數檢測靈敏度。而對于ddPCR來說，體系分隔過程將反應體系平均分配到幾萬個反應腔室中，這顯著降低了每個微體系中PCR抑制劑的量，使得ddPCR的反應效率大大優于qPCR，釋放了靶模板分子自身特異性擴增的效率。

此外，在qPCR中，一個Ct值的差異會導致一倍的定量結果差別，所以qPCR在區分兩倍以內差異的靶模板分子，如單倍體與二倍體、二倍體與三倍體等特殊場合難以實現準確區分，而ddPCR直接絕對定量、單分子檢測靈敏度、對于微小變化的敏感檢測的特性使得其在應用于上述特殊場合中游刃有余。

數字PCR技術發展使得PCR定量完成了由間接定量到直接定量，由相對定量到絕對定量轉變。數字PCR的絕對定量能力，使同一檢測在不同時間、不同批次、以及不同實驗室間定量結果的比對與校正更加準確。而數字PCR單分子水平的檢測能力，也使它能夠勝任微量核酸分子的檢測。

結    語

技術革新的過程總是相似，日益提高的技術需求和日益復雜的應用場合催生著一代又一代新技術誕生。在精準醫療時代浪潮中，作為引領PCR技術格局的數字PCR技術，將為腫瘤液體活檢、無創產前篩查、重癥感染早期診斷、器官移植檢測等重大醫學問題提供強勁有力的驅動引擎。

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