單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）的十個問答解惑
Q1：為什么要進行單細胞測序？
A1：單細胞，就是從單個細胞出發去做研究。細胞是組成生命體的最基本單元，從基本單元出發去研究，才能從小到大，以點到面，從局部到整體去理解生物學問題。曾經有朋友給我看了下面的圖片，形象地展示了從Bulk研究到單細胞研究的必要性。
Q2：單細胞測序能做哪些層面的檢測？
A2：單細胞研究現在最多的是轉錄組研究，稱為scRNA-seq的方法進行單細胞轉錄組測序。當然，雖然已發表的研究很多，但可實現的檢測還有染色質可接近性檢測（chromatin accessibility，ATAC-seq）,CNV檢測，免疫組庫測序，表面蛋白檢測。
Integrative single-cell analysis.Nat Rev Genet. 2019 Jan 29.
Q3：高通量單細胞轉錄組測序的樣本有什么要求？
A3：要想成功做成單細胞轉錄組測序，第一個要求是細胞要是活的，現有商用平臺對細胞活率要求較高，最好能達到90%，原代細胞不能低于70%。另外，高通量檢測需要原始提供的細胞數量足夠，如果一次實驗最終檢測到成千上萬個細胞，需提供高質量細胞量達到10的5次方以上。同時，細胞形態大小也有要求，一般細胞直徑在幾十微米以內，最好40以下。植物細胞需要去除細胞壁，制備原生質體。
Q4: 不滿足上述細胞樣本要求，還能做scRNA-seq嗎？
A4: 可以。由于實驗樣本特殊性，不是所有的細胞都能滿足現有測序要求，比如神經細胞等。這種情況下，進行細胞核提取，進行核轉錄組檢測是備選方案。當然，細胞核的轉錄組檢測不能反應所有的細胞信息，但是現有的研究已證明核RNA也能反應細胞特征。
Science. 2019 May 17;364(6441):685-689.
Q5: 怎么定義數據分析得到的細胞類群？
A5: 單細胞轉錄組數據分析后會對細胞類型進行區分，并且能得到每個類型的marker基因。但是，這個結果是不能將類群定義為現有認知的已知類型。因此，需要對已知類群marker基因和數據分類得到的markers進行匹配。如果匹配到某個類群里有已知的marker，就能對這些類群進行已知類型標記。
Q6: 不知道研究的組織有哪些marker，怎么辦？
A6: 雖然研究者對自身研究領域的marker有所了解是天經地義的事情，但是對于剛入門的小師弟小師妹來說可能難度有點大。幸運的是，現有的一些數據庫可以給我們提供信息：
1.CellMarker(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/)，提供人的158個組織器官和小鼠81個器官的marker信息。數據信息收集來自100,000篇文獻報道。絕對是Marker界的數據庫Number 1；
2.CancerSEA(http://biocc.hrbmu.edu.cn/Can-cerSEA/)，收錄25種腫瘤類型的4萬多個單細胞數據。研究腫瘤的，不得不看的數據庫。
Q7: 單細胞轉錄組數據可以做哪些后期數據挖掘？
A7: 除了細胞定義之外，單細胞轉錄組數據后續可以進行轉錄因子預測，擬時序分析，細胞-細胞互作預測，細胞功能富集等數據挖掘。目的只有一個，通過每一個細胞中的基因表達，去推測細胞特定的生物學功能。
Q8: 擬時序分析可解決什么問題？
A8: 擬時間序列分析（Pseudotime分析）的字面意思是通過構建細胞間的變化軌跡來重塑細胞隨著時間的變化過程。推斷單細胞軌跡是一個機器學習問題。第一步是選擇機器學習方法輸入的基因。這叫做特征選擇，它對軌跡的形狀有很大的影響。算法通過檢查這些基因在細胞群中的表達模式來對細胞進行排序。尋找以“有趣”(即不只是嘈雜)方式變化的基因，并利用這些基因來構造數據。這些基因將產生一個健壯、準確和具有生物學意義的軌跡。因此，擬時序分析后的數據可以反應細胞的變化過程，對于細胞發育過程，腫瘤演化等的理解非常有用。
Nat Methods. 2016 Oct;13(10):845-8.
Q9: 現有的單細胞轉錄組測序有哪些可選平臺？
A9: 現有市場上運用最廣，認可度最高的是10X Genomics的Chromium System，BD公司的Rhapsody Single-Cell Analysis System也是不錯的平臺。這兩個系統分別使用微滴微流控系統和微孔微流控系統。
Q10: 多個單細胞轉錄組測序，貴嗎？
A10: 這個問題相信是大家最關心的。怎么說呢，scRNA-seq說貴也貴，說不貴也不貴。單個樣本，現在的市場價在5位數的級別，但是平均到每個細胞，大概在10塊錢。所以，從某種意義上來說，單細胞轉錄組測序，還是性價比很高的。只選對的，不選貴的，當一切以解決科學問題為目的，錢只是實現目的的工具而已。
