新型超微量染色質免疫共沉淀ChIP-seq技術-Cut&Tag
文章導讀
染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation , ChIP）是研究蛋白質與DNA互作的標準方法。通過與高通量測序技術相結合，研究者開發了ChIP-seq技術，從而獲得全基因組范圍內與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA片段信息，目前被廣泛應用于轉錄調控、表觀遺傳等研究領域。但是ChIP-seq的應用存在諸多限制：整個過程十分復雜，實驗重復性差，需要甲醛交聯，并且高度依賴抗體；此外，為了獲得有效富集信號，需要大量細胞投入，這使得ChIP-Seq在少量細胞如早期胚胎細胞、干細胞等研究領域力不從心。
新方法、新技術的革命往往給科學研究帶來天翻地覆的變化。近期出現的Cut&Tag將繁復的ChIP-Seq變成便捷簡單的操作，為研究DNA-蛋白質相互作用提供了有效的工具。2019年4月，弗雷德哈欽森癌癥研究中心的Henikoff博士在國際知名學術期刊Nature Communications上發表了Cut&Tag技術，與傳統ChIP-Seq方法相比，Cut&Tag技術方法簡便易行，信噪比高，重復性好，需要的細胞數量少至60個，且有望將ChIP-Seq做到單細胞水平，開創了ChIP-seq新革命。小編帶領大家一起來領略這項前沿技術的風采。
原文鏈接：Cut&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells
發表期刊：Nature Communications
影響因子：11.878
發表日期：20190429
1.Cut&Tag原理
ChiTag是Protein A蛋白與Tn5轉座酶的融合蛋白，當抗體結合目的蛋白（如轉錄因子、組蛋白等）后，Protein A蛋白可直接結合抗體，攜帶的Tn5轉座酶可特異性的切割目的蛋白附近的DNA片段，并將DNA片段連上接頭，文庫構建后進行高通量測序。
圖1 Cut&Tag實驗流程圖
2. Cut&Tag優勢
為證明Cut&Tag技術的有效性，作者在對組蛋白H3K27me3進行研究時對比使用了ChIP-seq、Cut&RUN、Cut&Tag三種方法。從不同角度對三組數據進行比較后，發現Cut&Tag技術具有顯著優勢，具體結果如下：
（1）背景噪音低
為了直接比較這三種技術，作者將三種方法的數據量都設置為8M Reads，結果發現三種方法得出的峰圖相似，但是ChIP-seq的背景噪聲非常高，增加數據量到50M Reads時，才能達到類似的峰圖，因此ChIP-seq需要更大的測序深度才能將染色質特征與背景區分開。相反，Cut＆RUN和Cut＆Tag均具有極低的背景噪聲水平，其中Cut＆Tag的背景噪音最低。
圖2 三種方法背景噪音比較
（2）信號值高，靈敏度好
為了量化三種方法的敏感性，作者分別檢測了三種方法不同測序深度下峰的富集效率圖，發現Cut＆Tag可以更快地填充低測序深度的峰，其中約2M Reads相當于Cut＆RUN的8M Reads或ChIP-seq的20M Reads，結果表明相同測序深度下，Cut＆Tag檢測的信號值更高。同時，作者又分析了相同測序深度下（8M Reads），峰圖形成的靈敏度，由于ChIP-seq的靈敏度相對較低，所以作者增加了一個40M Reads數據量下的峰圖，比較后發現仍舊是Cut＆Tag峰圖最顯著，且比ChIP-seq的40M Reads峰圖都高，表明Cut＆Tag的靈敏度最高。
圖3 三種方法信號強度比較
（3）重復性好
為了檢測三種方法的可重復性，作者分別對三種方法做了兩次重復實驗，并對實驗結果進行分層聚類相關矩陣分析，證明了Cut＆Tag實驗可重復性最好。
圖4 三種方法重復性相關矩陣
總結
Cut&Tag是蛋白質-DNA互作關系研究的新方法，相較于傳統的ChIP-Seq具有以下優點：所需細胞量少，背景信號低，可重復性好，無需ChIP級別抗體等優點，甚至可用于單細胞水平測序。Cut&Tag技術可從基因組范圍內檢測組蛋白、RNA polymerase II和轉錄因子等蛋白質結合的DNA區端，應用于臨床和科研的表觀遺傳學研究，或是結合生物信息學分析，找到轉錄因子下游調控的靶基因，為進一步闡明生物學機制提供依據。
云序生物Cut&Tag技術服務：
Cut&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是蛋白質-DNA互作關系研究的新方法，是新一代超微量ChIP-Seq技術，適用于無ChIP級別抗體的蛋白研究。與傳統的ChIP-Seq研究方法相比，該技術無需交聯、超聲打斷、末端抹平和接頭連接等操作，因此具有省時高效、所需樣品量少、背景信號低和可重復性好等優點，甚至可用于單細胞水平測序。Cut&Tag有望將蛋白質-DNA互作的研究變成一種類似PCR反應的常規操作，對基因調控、表觀遺傳等領域的研究具有革命性的意義。
產品優勢
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樣品起始量低：能夠對及少量樣品進行分析
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無需ChIP級別抗體：無需提供ChIP級別抗體
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性價比高：背景噪音低，所需測序深度少
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實驗重復性好：實驗重復結果一致性好
實驗流程
云序生物Cut&Tag實驗流程圖
樣本要求
1）樣品類型：細胞、組織，其它樣品信息請詳詢
2）樣品量
細胞：5×105
組織：5mg
3）樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊，液氮凍存后，-80℃ 保存。
4）樣品運輸：干冰運輸。
云序生物分子互作技術：
云序作為一家依托于高通量測序的科研服務公司，除了提供優質測序服務，還為客戶提供機制研究的服務，助力用戶發表高分文章，其中包括研究蛋白互作的CoIP技術、RNA與蛋白/RNA互作的RNA pull-down技術、蛋白與DNA互作的ChIP和ATAC技術，近期更推出了新一代ChIP-seq技術Cut&Tag，囊括了DNA、RNA和蛋白質這三類經典大分子互作研究的重要技術。
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Cebola Inês,Pancreatic Islet Transcriptional Enhancers and Diabetes.[J] .Curr. Diab. Rep., 2019, 19: 145.
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