體內堿性彗星試驗方法及導則
體內堿性彗星試驗在化合物遺傳毒性評價中的應用日益廣泛。ICH S2(R1)已將肝臟彗星試驗列為第2個組織/終點的體內試驗；體內哺乳動物堿性彗星試驗的指導原則（TG489）也已頒布。體內堿性彗星實驗能夠檢測DNA鏈斷裂、堿性不穩定位點、不完整切除修復引起的DNA鏈的斷裂等任何感興趣，能夠制成合適細胞懸液的組織DNA損傷。與其他試驗相比其檢測的是單細胞水平的DNA損傷，因此該試驗敏感性較高，操作簡單，經濟省時。
實驗原理
彗星實驗（comet assay）也稱單細胞凝膠電泳試驗（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一種有效評估DNA損傷的方法。其原理是器官或組織經處理（如輻射、重金屬等）后，細胞中的DNA發生單鏈或雙鏈斷裂，經細胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場作用下，DNA 斷片遷移出細胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實驗（pH=8.4）和堿性彗星實驗（pH＞13）。中性彗星實驗主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實驗具有更高的靈敏性，可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。
需要注意的是，試驗過程中的個方面，包括樣品準備、電泳條件、視覺分析參數(如染色強度、顯微鏡光強度以及使用顯微鏡濾鏡和相機動態和環境條件(如背景照明)已經被研究，可能影響DNA遷移。
堿性彗星試驗指導原則
TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals
試驗能力驗證
每個實驗室都應證明能夠為所使用的目標組織獲得足夠質量的單細胞或細胞懸浮液，從而在彗星試驗中建立實驗能力，北京匯智泰康醫藥技術有限公司可提供專業毒理學服務。首先通過%尾DNA的評價，對照處理組動物%尾DNA在低范圍內。目前的數據表明,尾部DNA百分比(基于平均中位數)在大鼠肝臟應該最好不要超過6%,這將是符合JaCVAM驗證試驗的值和其他出版和私有數據。目前還沒有足夠的數據對其他組織的最佳或可接受范圍提出建議。這并不排除合理使用其他組織。測試報告應根據已發表的文獻或專有數據，對彗星試驗在這些組織中的性能進行適當的審查。首先，在對照組中，需要一個較低的%尾DNA范圍，以提供足夠的動態范圍來檢測陽性的影響。其次，每個實驗室都應能夠按照表1所建議的不同方式，對直接誘變劑和促進劑的反應。

表一：陽性對照物質及其部分靶組織

陽性對照物	靶組織
Ethyl methanesulfonate	任何組織
Methyl methanesulfonate	肝臟、胃、十二指腸或空腸，肺和支氣管肺泡灌洗(BAL)細胞，腎臟，膀胱，肺，睪丸和骨骼骨髓/
Ethyl nitrosourea	肝胃，十二指腸或空腸
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine	胃、十二指腸或空腸
1,2-Dimethylhydrazine 2HCl	肝臟和腸
N-methyl-N-nitrosourea	肝臟，骨髓，血液，腎臟，胃、空腸和大腦。

應收集陰性對照數據，以證明陰性數據反應的再現性，并確保對檢測的技術方面進行適當控制，或建議需要重新建立歷史控制范圍。
歷史對照
在實驗室能力驗證過程中，實驗室應建立歷史數據庫，建立相關組織和物種的陽性和陰性對照范圍和分布。不同的組織和不同的物種，以及不同的給藥溶媒和給藥途徑，可能會產生不同的%尾DNA陰性對照值。因此，建立每個組織和物種的陰性對照范圍是很重要的。實驗室應采用質量控制方法，以確定其數據的變化程度，并表明該方法在其實驗室中得到了“控制”。可能還需要優化選擇適當的陽性對照物質、劑量范圍和實驗條件(例如電泳條件)，以便發現微弱的影響。
對實驗方案的任何更改都應根據其與實驗室現有歷史控制數據庫的一致性加以考慮。任何重大的不一致都應導致建立新的歷史控制數據庫。
方法描述
動物選擇：通常使用健康成年嚙齒動物(6-10周齡，但年齡稍大的動物也可接受)。
動物準備：動物隨機分為對照組和實驗組。在開始實驗前，這些動物適應實驗室條件至少5天，給予標識識別。試驗開始時,動物的重量差異應該不超過±20%。
樣品制備：在給動物給藥前，固體測試化學品應溶解或懸浮在適當的溶媒中，或混合在飲食或飲用水中。液體試驗化學品可直接加藥或在加藥前稀釋。對于吸入暴露，根據其物理化學性質，試驗化學品可以作為氣體、蒸汽或固體/液體氣溶膠使用。
溶媒：在使用的劑量范圍內，溶媒不應產生毒性作用，也不應與試驗物質發生化學反應。如果使用的不是常用溶媒應提供參考數據，說明它們在測試動物、管理路線和終點方面的兼容性。建議在可能的情況下，應首先考慮使用水性溶劑/溶媒。值得注意的是，一些溶劑可誘導炎癥反應，增加接觸部位DNA鏈斷裂的背景水平，尤其是與多藥給藥時。
陰性對照：陰性對照動物，單獨用溶媒處理，其他處理方法與治療組相同，每一次采樣時間和組織的每次檢測均納入一組陰性對照動物。陰性對照動物的尾部DNA應在每個組織預先設定的實驗室背景范圍和該物種的取樣時間內。
動物數量和性別：目標是每組提供至少5只可分析的單性別動物，或如果使用兩種動物，則每組至少提供5只可分析的單性別動物。如果人類接觸到的化學物質可能具有性別特異性，例如某些藥物，則應在適當的性別下進行檢測。三個劑量組和同時進行的陰性和陽性對照(每一組由5只單性別動物組成)，將需要25至35只動物。
試驗計劃：動物應接受為期2天或以上的每日給藥(即每隔約24小時進行兩次或兩次以上)，并在最后一次治療后的2-6小時采集一次樣本。延長劑量方案(如28天每日給藥)的樣本是可以接受的。測試化學品也可以分次使用，即，兩組給藥在同一天間隔不超過2-3小時，便于給藥量大。在這種情況下，取樣時間應根據最后一次給藥的時間來安排。
劑量水平：對無毒試驗化學品，給藥14天以上的，最大(限)劑量為1000mg /kg體重/天。給藥時間少于14天，最高劑量為2000毫克/公斤體重/天。
采樣時間：采樣時間是一個關鍵變量，因為它是由測試化學物質在目標組織中達到最大濃度所需的時間和DNA鏈斷裂的誘導時間決定的，但在這些斷裂被移除、修復或導致細胞死亡之前。
組織收集：因為它可以研究誘導的DNA鏈斷裂(彗星)在任何組織中,組織選擇應清晰、基于收集的原因進行研究與任何現有的基因毒性、致癌性或其他測試物質的毒性數據在調查之中。應考慮的重要因素應包括給藥途徑、預測的組織分布和吸收、代謝的作用以及試驗物質可能的作用機制。肝臟是研究最頻繁、數據最豐富的組織。因此，在缺乏任何背景信息的情況下，如果沒有確定感興趣的特定組織，那么對肝臟進行取樣是合理的，因為肝臟是異種生物代謝的主要場所，而且常常高度暴露于母體物質和代謝物中。在某些情況下，直接接觸部位的檢查(例如，口服藥物，胃腺或十二指腸/空腸，或吸入藥物，肺)可能是最相關的。應根據進行測試的具體原因選擇其他或替代組織，但如果實驗室已證明對這些組織的熟練程度和同時處理多個組織的能力，對同一動物的多個組織進行檢查可能是有用的。
樣本制備：在最后一次用測試化學品后的適當時間，對動物實施安樂死。收集選定的組織,而同時采集同一組織的一部分,放置在甲醛溶液或適當的固定劑可能組織病理學分析。彗星實驗的組織被放置在切碎緩沖液中，用冷切碎緩沖液充分沖洗以去除殘留的血液，并儲存在冰冷的切碎緩沖液中，直到處理完畢。原位灌注也可進行，如肝、腎灌注。
玻片準備：單細胞懸液制備后，應盡快(最好在1小時內)制備載玻片，但動物死亡與載玻片制備之間的溫度和時間應嚴格控制，并在實驗室條件下進行驗證。向低熔點瓊脂糖(通常0.5-1.0%)中加入細胞懸浮液的體積，使玻片的低熔點瓊脂糖百分比不應降低到0.45%以下。最佳的細胞密度將由用來給彗星評分的圖像分析系統決定。
細胞裂解：裂解條件也是一個關鍵變量，可能會干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內收)導致的鏈斷裂。因此，我們建議在實驗中對所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準備好后，應在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光)，將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(或過夜)，以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后，在堿液展開步驟之前，應沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來完成。也可以使用電泳緩沖液。這將維持電泳室的堿性條件。
解旋和電泳：將載玻片隨機放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺上，使載玻片表面完全覆蓋(每次覆蓋的深度也應一致)。在其他類型的彗星試驗電泳裝置，即主動冷卻，循環和高容量電源，較高的解決方案覆蓋將導致更高的電流，而電壓保持不變。
測量方法：彗星應該使用自動化或半自動化的圖像分析系統進行定量評分。用合適的熒光染色劑對載玻片進行染色，并在配備有超熒光和適當檢測器的顯微鏡或數碼相機上進行適當放大(如200x)的測量。
根據彗星圖像圖譜的描述，細胞可以分為三種類型，即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的細胞(明確定義的頭部和尾部，不干擾相鄰的細胞)應該為%的尾部DNA，以避免人為干擾。刺猬的頻率應該根據每個樣本至少150個細胞的視覺評分(因為缺少一個清晰定義的頭部意味著它們不容易被圖像分析檢測到)來確定，并單獨記錄下來。
所有用于分析的玻片，包括陽性和陰性對照的玻片，都應獨立編碼并進行“盲法”評分，以便評分者不知道情況。對于每個樣本(每個動物的每個組織)，至少應該分析150個細胞(刺猬除外)。分析150細胞/動物至少5動物每劑，提供足夠的統計能力。
彗星DNA鏈斷裂可以通過尾DNA %、尾長和尾力矩等獨立端點來測量。如果使用適當的圖像軟件分析儀系統，就可以進行這三種測量。然而，推薦將%尾DNA(也稱為%尾強度)用于結果的評估和解釋，并由以細胞總強度百分比表示的尾DNA片段強度決定。
數據處理和結果判斷
在實驗條件下，陽性對照組的尾DNA%的與陰性對照相比具有統計學意義上的增加（p<0.05）時，判定試驗系統有效。
在試驗系統判定有效的前提下，同時滿足以下三個條件，則判定受試樣品為陽性結果：
（1） 尾DNA%的在某個單獨劑量組顯著升高；
（2） 尾DNA%隨試驗樣品濃度升高有顯著增加趨勢；
（3） 受試物組的尾DNA%全部超過陰性背景數據范圍。
在判定陽性結果時，如僅符合上述標準中的一個或兩個，除統計學意義外，還應考慮其生物學意義。
如全部不符合上述3個，則判定為陰性結果。
 
彗星試驗試劑盒
北京匯智泰康醫藥技術有限公司針對堿性彗星試驗開發試劑盒，本試劑盒省去了試驗溶劑配制、溶膠配制不穩定等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經過嚴格的質量檢測，符合堿性彗星試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現性高。堿性彗星試劑盒應用廣泛，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒理學檢測。
 
【產品說明】
    本試劑盒提供了單細胞凝膠電泳試驗需要的試劑和耗材。
試劑名稱 規格 數量 儲存條件
 

包裝盒	產品組成	規格	數量	保存條件
堿性彗星實驗盒	細胞裂解液	500 mL	1	室溫
	電泳膠A	10 mL	1	室溫
	電泳膠B	15 mL	1	4℃
	玻片	2孔	30	室溫
	200 mM EDTA, PH 10	12.5mL	1	室溫
	核酸染料	10 ul	1	4℃
	DMSO	50 mL	1	室溫

• 細胞裂解液避免了多成分配制的繁瑣工藝，保證了每次實驗細胞裂解的穩定性。
• 電泳膠經過采用先進工藝規模化制備，出廠前經過嚴格的質量檢測，實驗時直接溶解即可使用。
• 針對實驗設計的兩孔式玻片增加了溶膠的粘附性，使細胞完整，便于拍照分析。

【試劑盒應用范圍】
本試劑盒應用范圍非常廣，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學檢測。
【傳統試驗操作不足】

• 溶液配制繁瑣，每次配制裂解效果不同。
• 不同膠濃度會影響DNA尾百分數，過低濃度的膠穩定性差，過高濃度的膠會抑制彗星尾的產生，且反復溶膠會導致儲備液蒸發，影響試驗結果。
• 傳統玻片對溶膠的粘附性較低，且溶膠易流出玻片，損失較大。

【試劑盒優勢】
便捷——匯智泰康彗星試驗試劑盒省去了裂解液配制時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。
準確——匯智泰康彗星試驗試劑盒各成分均經過嚴格質量檢測，實驗結果準確、可靠、重現性高。
穩定——匯智泰康彗星試驗試劑盒穩定性強、易于運輸和保存。