1873年，德國醫師Ernst Abbe 提出了“衍射極限”的概念。他預測，由于光的基本衍射性質，光學顯微鏡無法實現200nm以下的分辨率。實際上，當兩個相隔很近的物點同時發光時，得到的圖像是模糊的，無法分辨。超分辨率顯微鏡（SRM）的誕生打破了一個世紀多以來一直被認為無法突破的瓶頸。

 

如今，科學家們已經研發了多種超分辨率技術，遠遠超出了衍射極限，能夠觀察到分子尺度的細節。SRM技術可以將細胞結構解析為亞細胞水平，從而獲取有關細胞組分的3D結構的信息，并可以觀察到單分子共定位。

 

下面我們來簡要概述了時下幾種最流行的SRM技術的原理：

 

 

1.受激發射耗竭（STED）顯微鏡

 

STED對于有經驗的熒光顯微鏡使用者來說相對簡單，該方法和普通共聚焦顯微鏡（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用單光源，而STED使用雙光源。其中一個光源發射能激發熒光團——熒光標簽（研究者們以此來定位和觀察蛋白）的光，另一個光源發出不同波長的光，用于抑制熒光。這束光是環形的，并且與第一束光有所重疊，因此只有環形中間區域的分子會繼續發出熒光。

 

獲得STED超分辨率圖片并沒有那么復雜，用戶需要仔細調整參數，才能得到漂亮的結果，否則所得圖片和普通confocal沒有差別。

 

使用傳統和RESCue受激發射減損顯微鏡（STED）得到的細胞核膜上核孔復合體的圖片。

 

STED的原理：

 

顯微鏡透鏡對光的衍射會導致來自單個點的光出現在較大的區域，這稱為點擴散函數（PSF）（見圖1），由于PSF的存在，使得常規顯微鏡無法達到超分辨。

 

 

圖1：在普通光學顯微鏡中，成像是通過將來自點光源的光線會聚到像平面上的單個點來實現的。超出光衍射的限制，防止了射線的精確會聚，從而導致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決于點擴散函數（PSF）的大小，或對象在某個點的三維強度分布。在STED中，應用環形炸彈耗盡型激光器，其零點與激發激光焦點的最大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”，從而“抑制了來自零點附近區域的熒光，導致有效PSF的尺寸減小”。

 

而受激發射耗竭（STED）顯微鏡通過限制樣品的熒光區域（PSF）產生超分辨率圖像。STED顯微鏡使用兩個重疊的激光，第一個按照常規顯微鏡激發熒光團（圖2A）。第二個激光器稱為耗盡激光器（STED激光器），它激發“甜甜圈”形狀的激光，其中心的零強度點非常小（〜30 nm）（未激發）。除了在甜甜圈的中心處之外，第二激光起到了“關閉”第一激光所產生的外圈熒光，從而將樣本激發的熒光分子范圍縮小到中心圓點處，這有效地降低了PSF，以產生非常小的單分子熒光聚焦區域，從而獲得高分辨率圖像（圖2D）。

 

圖2：

 

單個小于250 nm的蛋白質無法通過標準共聚焦成像解析，從而導致圖像模糊

STED耗盡激光器產生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”

飽和耗盡在功能上降低了激勵PSF

隨之可以解析單個蛋白質

 

適用于STED的熒光團偶聯抗體：

 

為了獲得超分辨率，染料必須具有STED激光波長的高發射截面，并有效地實現高飽和度。這種強烈的照明確保了所有被STED激光“關閉”的分子都受受激發射的支配。合適的染料應具有低的光漂白性，具有高的量子產率和對比度，并在目標附近具有足夠的標記密度。

 

Jackson提供熒光染料標記的二抗，下列染料標記的二抗已被驗證在STED中成功使用： AlexaFluor®488（如：115-545-003），FITC（如：715-095-150），AlexaFluor®594（如：715-585-151）和AlexaFluor®647。

 

2. 隨機光學重建顯微鏡（STORM）

 

最有名的“基于探針”的技術是Betzig等人研發的光激活定位顯微技術（photoactivated localization microscopy, PALM）和哈佛大學莊小威實驗室發明的隨機光學重建顯微技術(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的熒光標簽都是暗的。然后使用激光脈沖來激活一小部分熒光標簽，隨后使用另一束光來關閉這些熒光標簽。不斷重復這個過程，生成一系列部分熒光圖，最后重建成整個視野的熒光圖。，以產生分辨率優于常規方法收集的圖像。

 

使用超分辨率隨機光學重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科學家首次觀察到了神經元軸突的細胞骨架。

 

Jackson提供適用于dSTORM應用的標記二抗，簡而言之，較低強度的激發光激發樣品，隨機激活少量染料分子。單個發熒光的染料分子足夠分散，因此可以計算其點擴散函數的中心，從而推斷出染料的確切位置。然后使用第二激光關閉所有分子，并重復該過程。然后，通過重疊每種染料的所有映射點擴展函數，以數學方式生成高分辨率圖像。

 

用于單分子定位實驗的熒光團偶聯抗體
 

用于單分子定位的最佳染料通常非常亮，并產生足夠的光子以可靠地產生緊密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多種廣譜范圍內的可靠染料，例如AlexaFluor®488，AlexaFluor®647和Cy™5，可用于這些類型的實驗。

 

建議用于超分辨率顯微鏡的熒光染料偶聯物：

 

STED	激發波長（nm）	發射波長（nm）
Alexa Fluor® 488	493	519
熒光素 / FITC	492	520
Alexa Fluor® 594	591	614
Alexa Fluor® 647	651	667

 

STORM	激發波長（nm）	發射波長（nm）
Alexa Fluor® 488	493	519
Alexa Fluor® 647	651	667
Cy™5	650	670

 

每種SRM技術都有各自的探針選擇要求，Jackson ImmunoResearch提供多種已知在SRM應用中表現良好的熒光標記二抗。應該注意的是，SRM領域變化迅速，因此，建議從專業技術文獻中尋求信息，以幫助選擇合適的熒光團。

 

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