超敏一步巢式Taqman qPCR熒光核酸檢測技術(shù)的機理及應(yīng)用優(yōu)勢
巢式PCR具有很高的靈敏度和特異性，但傳統(tǒng)的巢式PCR采用兩對引物，通過兩輪PCR，進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增。這種操作的不便性，使得其高靈敏度的特性難以應(yīng)用到快速檢測和臨床診斷中。在單管巢式PCR的擴(kuò)增中，由于內(nèi)側(cè)引物會阻礙外側(cè)引物的擴(kuò)增，因此標(biāo)準(zhǔn)的Taq DNA聚合酶不能在單管巢式PCR的擴(kuò)增中，發(fā)揮其高靈敏度的特性。采用耐高溫、且具有鏈置換活性的聚合酶，可保證在單管反應(yīng)中，內(nèi)外兩側(cè)引物同時擴(kuò)增，巢式PCR才能達(dá)到真正意義上的高靈敏度。一步法巢式PCR（One-Step Nested PCR）技術(shù)最早報道于2013年，雖然其擁有高靈敏度的檢測特性，但始終未能在核酸檢測領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。其主要原因是SD聚合酶的鏈置換活性過于強烈，而導(dǎo)致外切酶活性作用的機會太弱，導(dǎo)致高信噪比的TaqMan探針無法應(yīng)用于One-Step Nested PCR。因此，One-Step Nested PCR的熒光探針檢測只能依靠特異性和信噪比欠佳的發(fā)卡FRET探針。
憑借在分子工具酶改造工作中積累的的豐富經(jīng)驗，開發(fā)出具有探針切割活性的SD 2.0 DNA Polymerase和SD 3.0 DNA/RNA Polymerase，結(jié)合獨有的P-Bond錨定探針技術(shù)，將高信噪比的TaqMan探針應(yīng)用到One-Step Nested PCR上，建立起了TaqMan One-Step Nested qPCR方法。運用TaqMan One-Step Nested PCR方法檢測DNA或RNA分子，在檢測靈敏度和擴(kuò)增速度方面，都是傳統(tǒng)TaqMan PCR法難以企及的。因此，TaqMan One-Step Nested PCR技術(shù)將是未來基因檢測市場爭奪戰(zhàn)中的最有利武器之一。
一、One-Step Nested PCR 高靈敏度機理
在標(biāo)準(zhǔn)PCR過程中，使用上游和下游兩條引物對靶基因進(jìn)行熱循環(huán)擴(kuò)增，每經(jīng)過一個循環(huán)的擴(kuò)增，產(chǎn)物最多變?yōu)?倍。而在One-Step Nested PCR(或稱為PCDR法，Polymerase Chain Displacement Reaction)的擴(kuò)增中由于使用兩條上游引物和兩條下游引物，因此在每次熱循環(huán)過程中，產(chǎn)物增加近4倍，在經(jīng)過30-40次循環(huán)后，核酸產(chǎn)物將會高于PCR法成千上萬倍，并且所需的循環(huán)數(shù)更少。在核酸檢測的實驗中，One-Step Nested PCR法比標(biāo)準(zhǔn)PCR法靈敏度要高10-100倍，并且更容易開發(fā)出高靈敏的檢測試劑盒。
二、TaqMan One-Step Nested qPCR熒光法核酸檢測技術(shù)
TaqMan One-Step Nested qPCR技術(shù)是在PCDR的基礎(chǔ)上，研發(fā)團(tuán)隊利用具有探針切割活性的SD2.0或SD3.0 DNA/RNA聚合酶，結(jié)合獨特的P-Bond探針錨定技術(shù)開發(fā)的一項新的核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)較目前核酸檢測工作中常用的Taqman qPCR技術(shù)，在靈敏度和擴(kuò)增速度上，具有極大的優(yōu)勢，因此該技術(shù)在目前和未來的核酸檢測領(lǐng)域具有極大的推廣和應(yīng)用價值。
TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能對比
| TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能對比 | ||
| TaqMan PCR | TaqMan One-Step Nested PCR | |
| 擴(kuò)增引物數(shù) | 兩條 | 四條或六條 |
| 探針 | 雙標(biāo)熒光探針 | 雙標(biāo)P-Bond熒光探針 |
| 熱循環(huán)倍增數(shù) | <2 | >2 |
| 擴(kuò)增條件 | 熱變性循環(huán) | 熱變性循環(huán) |
| 檢測設(shè)備 | 標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀 | 標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀 |
| 數(shù)據(jù)判讀方式 | 擴(kuò)增曲線或Ct值 | 擴(kuò)增曲線或Ct值 |
| 對模板變異敏感度 | 較敏感 | 不敏感 |
| 5 copy靈敏度 | 開發(fā)難度大，判讀困難 | 開發(fā)容易，判讀容易 |
| 5 copy Ct值 | 通常>34 | 通常<28 |
| DNA擴(kuò)增用酶 | Taq | SD 2.0 |
| RNA擴(kuò)增用酶 | Taq+MLV、TTx、mTTx、Z05 | SD 3.0 |
三、TaqMan One-Step Nested qPCR熒光法核酸檢測技術(shù)應(yīng)用策略
在TaqMan One-Step Nested PCR的實驗中，采用4條擴(kuò)增引物的情況下，檢測靈敏度和擴(kuò)增速度較傳統(tǒng)TaqMan PCR法會大幅提高。同時，由于采用了4條擴(kuò)增引物，當(dāng)在檢測變異度較高的RNA病毒時，突變對擴(kuò)增引物的影響顯著降低，從而避免了漏檢的可能性。當(dāng)再增加一條檢測探針時，對突變的敏感度進(jìn)一步降低，此時已經(jīng)與TaqMan PCR的雙重檢測防止漏檢的設(shè)計完全相同，但One-Step Nested PCR法檢測靈敏度更高。為了進(jìn)一步提高檢測靈敏度和擴(kuò)增速度，可以再增加一對擴(kuò)增引物，采用6引物進(jìn)行擴(kuò)增。
圖：TaqMan One-Step Nested PCR引物和探針設(shè)計原理
四、TaqMan One-Step Nested qPCR的引物和探針設(shè)計原則
| 表 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的引物設(shè)計參數(shù)對比 | ||
| TaqMan PCR | TaqMan One-Step Nested PCR | |
| 擴(kuò)增引物長度 | 18-26bp，條件完全相同 | |
| 擴(kuò)增引物TM值 | 55-60℃，條件完全相同（GC含量40-60%最佳 | |
| 探針長度 | 20-35bp | 20-28bp |
| 探針TM值 | 一般68℃（>引物10℃） | 一般63℃（>引物3-5℃） |
| 擴(kuò)增片段大小 | <200bp | <300bp（外側(cè)） |
| <150bp（內(nèi)側(cè)） | ||
| 探針位置 | 與引物3’端間隔2-6bp | 與引物3’端間隔4-20bp |
五、TaqMan One-Step Nested PCR的擴(kuò)增性能展示
1.以非洲豬瘟DNA病毒核酸檢測為例，進(jìn)行TaqMan One-Step Nested PCR與TaqMan PCR兩種方法性能的比較。
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| 圖A：傳統(tǒng)的TaqMan PCR法對10copy以下模板檢測困難， 通常Ct>35，不易判讀。 |
圖B：TaqMan One-Step Nested PCR法5copy的 DNA模板Ct<26，單copy分子Ct<30. 結(jié)果易于判讀。 |
2.以2019-CoV RNA病毒核酸檢測為例，應(yīng)用TaqMan One-Step Nested PCR進(jìn)行檢測。
圖A:針對2019-CoV的N基因使用的引物、探針策略圖示
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| 圖B：2019-CoV的N基因靶標(biāo)區(qū)段1（FAM通道）靈敏度測試 | 圖C：2019-CoV的N基因靶標(biāo)區(qū)段2（HEX通道）靈敏度測試 |
3.TaqMan One-Step Nested PCR用于SNP或變異毒株的分型檢測。
圖A:針對2019-CoV的S基因的D614G突變使用的引物、探針策略圖示
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| 圖B：2019-CoV病毒 D614G分型結(jié)果 |
圖C：2019-CoV病毒D614（野生型） 靈敏度測試 |
圖D：2019-CoV病毒G614（突變型） 靈敏度測試 |
