非酒精性脂肪肝疾病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種在無大量飲酒的患者肝臟中出現過量脂肪堆積而產生的類似于酗酒造成的肝臟損傷。而非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是NAFLD 的一種形式，除了肝臟中過量的脂肪堆積外，還伴隨著肝臟炎癥和不同程度的肝臟損傷。盡管多數NASH患者并無明顯癥狀，但NASH可能進一步發展為肝纖維化、肝硬化，甚至是肝癌。NASH在超重或肥胖的中年人群中比較常見，通常伴隨著高血脂（膽固醇和甘油三酯水平升高）和糖尿病的出現。NASH發病機制復雜，目前還沒有直接有效的藥物，治療方式主要是進行生活方式的干預，包括減輕體重、改變飲食、加強運動以及避免飲酒和服用不必要的藥物等[1]。因此，建立可靠的動物模型對探索NASH的發病機制及治療手段十分重要。

Henrik等人通過構建Gubra-Amylin NASH (GAN) 飲食誘導肥胖 (diet-induced obese，DIO) 小鼠模型（GAN DIO-NASH小鼠），在體內模擬NASH患者中的肝臟纖維化，并對該模型進行了臨床轉化性的評估[2]。
 

該研究使用含40%飽和脂肪、22%果糖和2%膽固醇的GAN飼料喂養C57Bl/6J小鼠38周以上，對代謝參數、血漿和肝臟的生物標志物進行了檢測，同時，也對小鼠肝臟病理學特征和轉錄組特性進行了評估，并與體重正常的健康人和NASH患者進行了對比。

GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝臟組織具有相似的病理學特征和量變
NASH 的主要病理學改變包括脂肪變性（steatosis），肝細胞氣球樣變（ballooning degeneration）、小葉炎癥（inflammation）和纖維化（fibrosis）。雖然肝纖維化實際上并不參與NAFLD活動評分（NAFLD activity score，NAS），但纖維化程度可以用于預后評估。

肝臟組織切片顯示，GAN DIO-NASH小鼠與NASH患者在脂肪變性、炎癥病灶和肝細胞氣球樣變上具有相似的形態學特征（圖1）。在GAN DIO-NASH小鼠肝小葉中，肝細胞脂質堆積呈分散式分布，主要表現為大泡性脂肪變性（macrovesicular steatosis）；且炎癥病灶中浸潤的免疫細胞主要是巨噬細胞和淋巴細胞形態的細胞。此外，在GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者中，肝小葉3區均能觀測到肝細胞氣球樣變，且兩者竇周隙膠原纖維的分布特征也相似。輕度纖維化（F1期）的GAN DIO-NASH小鼠主要表現為門靜脈周圍或竇周纖維化，F1期NASH患者則主要表現為竇周纖維化；而中度纖維化（F2期）的GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者都伴有門靜脈/門靜脈周圍纖維化和竇周纖維化。
 

圖1. GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝臟組織具有相似的病理學特征。（圖來源Ref.2）

肝活檢病理組織學評分也表明，25只GAN DIO-NASH小鼠中有22只出現肝纖維化，且幾乎都呈現輕度至中度纖維化（表1）。NAFLD活動評分也顯示，NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠具有相似的疾病嚴重程度（表2）。
 

表1. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠肝活檢組織病理學評分的比較。（表來源Ref.2）

表2. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠NAFLD活性評分(NAS)的比較。（表來源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者具有重疊的肝轉錄組譜
主成分分析（Principal components analysis，PCA）顯示，體重正常的健康人的肝臟轉錄組譜能與NASH患者的轉錄組譜清楚地分開，在小鼠中結果一樣（圖2A）。

而且在GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝臟活檢中發現了大量差異表達基因 (differentially expressed genes，DEGs)，且這些DEGs有著顯著重疊（圖2B）�；�因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）顯示，這些基因主要與營養代謝、免疫功能和細胞外基質（extracellular matrix ，ECM）組織結構有關（圖2C）。
 

圖2. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠的肝臟轉錄組變化。（圖來源Ref.2）

為了進一步探究GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者中肝臟轉錄組的調控，研究者們對與NASH病理學和纖維化相關基因的RNA測序數據進行了分析。結果顯示，與NASH患者相比，GAN DIO-NASH小鼠在七個既定基因組別中展現出葡萄糖代謝不足、脂質和膽汁酸處理受損、免疫調節受損、內質網 (ER) 應激、肝細胞損傷和ECM重塑活動的增強（圖3A）。另外，通過分析28個編碼NASH藥物靶點的基因，研究者們發現它們可被歸為3大類：脂質和葡萄糖代謝、炎癥，以及ECM組織結構（圖3B），且絕大部分基因在GAN DIO-NASH小鼠中都受到了明顯的調控。
 

圖3. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠中對疾病相關候選基因的調控。（圖來源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠表現出糖耐量受損
與普通飼料喂養的對照組小鼠相比，在實驗終點，GAN DIO-NASH小鼠體重明顯增加、全身脂肪量增加（肥胖），并出現肝腫大（圖 4A-4D），糖耐量（glucose tolerance）受損（圖 4E），高胰島素血癥（hyperinsulinemia）以及HOMA-IR 指數增加（圖 4F-G），還伴隨著高瘦素血癥和高膽固醇血癥（圖4H-I）。此外，雖然GAN DIO-NASH小鼠血漿游離脂肪酸水平有顯著升高（p = 0.05），但其血漿TG濃度并無顯著變化（p = 0.75）（圖4J-K） 。
 

圖4. GAN DIO-NASH小鼠具有代謝綜合征的特性。（圖來源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠血漿和肝臟的生化變化
對其他血漿和肝臟生化參數的分析結果顯示，與普通飼料喂養的對照組小鼠相比，GAN DIO-NASH小鼠血漿中肝臟受損的標志物（ALT、AST）和纖維化的標志物 (total CK18、MMP-9、TIMP-1）水平均有顯著升高，肝臟TG、TC和HP的濃度也有顯著增長，但肝臟MMP-9的水平并沒有顯著增加（表3）。
 

表3. GAN DIO-NASH小鼠中血漿和肝臟的生化變化。（表來源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠的血漿和肝臟中的細胞因子/趨化因子水平升高
對血漿和肝臟中的細胞因子/趨化因子水平的分析結果顯示，與普通飼料喂養的對照組小鼠相比，GAN DIO-NASH小鼠血漿和肝臟中的TNF-α、KC/GRO和MCP-1濃度均有顯著增長，特別是肝臟MCP-1。另外，GAN DIO-NASH小鼠血漿IL-6和IL-10，以及肝臟IL-1β和IL-5的濃度也有顯著提高。
 

表4. GAN DIO-NASH小鼠血漿和肝臟中的細胞因子/趨化因子水平升高。（表來源Ref.2）

小結
綜上，GAN DIO-NASH小鼠在生理、代謝和組織病理學方面都具有良好的臨床轉化性，可用于NASH發病機制的探索、潛在治療靶點的確定，以及新藥的研發。雖然可供選擇的治療靶點數目不少，在研藥物也不少（表5），但還沒有任何NASH藥物獲批。目前，奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA）是唯一一個在關鍵3期臨床試驗中獲得積極結果的藥物。然而，在最近的試驗中，OCA單一療法只能使不到三分之一的患者獲得NASH消退，因此，有研究者認為未來NASH的治療還是需要依靠聯合療法[3]。
 

表5. NASH藥物臨床試驗信息（表來源Ref.4）

賽業生物NASH小鼠模型助力新藥研發
賽業生物通過高脂高膽固醇高果糖飼料（GAN）喂養構建的NASH小鼠模型，可作為闡明非酒精性脂肪肝的病理生理機制以及新藥的開發的動物模型。

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