失巢凋亡是由于細胞脫離細胞外基質(zhì)而啟動的特殊的程序性細胞凋亡，在機體發(fā)育、組織自身平衡、疾病發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面起重要作用。BH3-only促凋亡蛋白Bmf是失巢凋亡的重要介質(zhì)。當細胞失去與細胞外基質(zhì)的附著時，系留在細胞骨架上的Bmf與動力蛋白輕鏈2（DLC2）發(fā)生解離，易位到線粒體，從而促進失巢凋亡的發(fā)生。然而，關(guān)于Bmf在細胞骨架上的系留及解離這一關(guān)鍵過程的調(diào)控機制仍然未知。

近日，西安交通大學邵永平/劉培軍/溫玉榮團隊合作在Cell Death & Differentiation期刊上發(fā)表了題為“Non-canonical phosphorylation of Bmf by p38 MAPK promotes its apoptotic activity in anoikis”的研究論文，揭示了失巢凋亡中Bmf活性調(diào)控新機制，并為Bmf蛋白細胞骨架的系留與解離過程提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
 

研究人員發(fā)現(xiàn)，當乳腺上皮細胞MCF-7和MCF10A脫離細胞外基質(zhì)、細胞凋亡信號上升時，p38 MAPK激酶呈現(xiàn)為迅速且持續(xù)活化狀態(tài)。而抑制p38信號通路或Bmf的選擇性敲除對失巢凋亡有挽救效果。因而該研究從乳腺上皮細胞失巢凋亡入手，基于MAPK信號通路在壓力應激誘導的細胞凋亡中的重要作用，探究失巢凋亡過程中上游p38激酶對Bmf促凋亡活性的可能調(diào)控機制。

p38激酶介導的Bmf T72磷酸化阻斷Bmf/DLC2相互作用
由于p38激酶和Bmf都參與了失巢凋亡的調(diào)節(jié)，研究人員推測激活的p38可能通過磷酸化調(diào)節(jié)Bmf的凋亡活性來調(diào)節(jié)失巢凋亡。初始研究表明Bmf在從細胞骨架上解離后發(fā)生多位點磷酸化修飾。根據(jù)生物信息學預測以及與同家族蛋白Bim的已知磷酸化位點對比分析發(fā)現(xiàn)T72，S74與S77位點可能為Bmf蛋白的磷酸化位點。通過表達純化野生型及這些位點突變的Bmf蛋白，結(jié)合p38體外激酶實驗，研究人員驗證了這三個位點可直接被p38激酶磷酸化。由于p38磷酸化位點( T72、S74和S77 )均位于Bmf的DLC2結(jié)合域內(nèi)或附近，研究人員研究了Bmf磷酸化對其與DLC2結(jié)合的影響(圖1 )。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T72磷酸化可以破壞Bmf / DLC2相互作用，而S74和S77磷酸化對此沒有影響。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Bmf T72的磷酸化可導致Bmf從細胞骨架的肌球蛋白V復合物中解離并易位到線粒體。
 

圖1. A：Bmf蛋白的DLC2結(jié)合域示意圖；B-F：純化的 6xHis-DLC2 蛋白與磷酸化Bmf多肽的結(jié)合測定。

Bmf/DLC2相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
為了解T72磷酸化對Bmf/DLC2相互作用影響的分子機制，研究人員以2.0μA的分辨率解析Bmf/DLC2復合物的晶體結(jié)構(gòu)(圖2)。根據(jù)DLC2 / Bmf復合物結(jié)構(gòu)，Bmf殘基T72利用其主鏈和側(cè)鏈與DLC2的F62形成兩個極性互作，增強復合物的穩(wěn)定性。為了進一步證實T72在DLC2/Bmf相互作用中的重要作用，研究人員發(fā)現(xiàn)T72A突變完全抑制了DLC2與Bmf的結(jié)合，而S74A/S77A雙突變Bmf保持了接近WT水平的DLC2結(jié)合能力。這些結(jié)果表明T72殘基（而非S74或S77）參與了Bmf與DLC2的結(jié)合，而磷酸化T72很可能通過空間位阻破壞Bmf/DLC2的相互作用。
 

圖2. Bmf/DLC2和Bim/DLC1復合物的結(jié)構(gòu)比較。

T72的擬磷突變增強了Bmf體外和體內(nèi)的凋亡活性
為了研究Bmf磷酸化對其凋亡活性的影響，研究人員構(gòu)建了可誘導表達WT或擬磷突變Bmf的MCF-10A和MCF-7細胞系，發(fā)現(xiàn)誘導表達T72擬磷突變Bmf相較于WT Bmf可顯著增強人乳腺上皮細胞的凋亡水平（圖3）。
 

圖3. T72的擬磷突變增強了Bmf體外凋亡活性。

接下來，為了檢測這種擬磷突變的體內(nèi)活性，研究人員委托賽業(yè)生物構(gòu)建了BmfT158E (相當于人體內(nèi)的BmfT72E )敲入小鼠模型，BmfT158E / T158E小鼠未見明顯發(fā)育缺陷，但淋巴細胞穩(wěn)態(tài)遭破壞，脾臟T，B淋巴細胞總數(shù)減少，小鼠脾臟重量減輕。此外，BmfT158E/T158E小鼠乳腺上皮細胞凋亡率明顯高于WT小鼠，乳腺導管內(nèi)徑變粗。上述結(jié)果說明T158E突變提高了Bmf的體內(nèi)促凋亡活性（圖4）。
 

圖4. T72 的擬磷突變增強了Bmf體內(nèi)凋亡活性。

總結(jié)
該研究從結(jié)構(gòu)層面解析Bmf/DLC2互作關(guān)系，并利用細胞系模型和BmfT158E knock-in小鼠模型研究磷酸化修飾對Bmf凋亡活性的活化機制，揭示了失巢凋亡中Bmf促凋亡活性調(diào)控的一種新機制，并為Bmf細胞骨架的系留與解離過程提供了的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

原文檢索：
Zhi Z, Ouyang Z, Ren Y, Cheng Y, Liu P, Wen Y, Shao Y. Non-canonical phosphorylation of Bmf by p38 MAPK promotes its apoptotic activity in anoikis. Cell Death Differ. 2021 Aug 30. doi: 10.1038/s41418-021-00855-3. Epub ahead of print. PMID: 34462553.

本文來自賽業(yè)生物(www.cyagen.com)