英文標題：Detection of Rare Mutations in  EGFR-ARMS-PCR-Negative LungAdenocarcinoma  by Sanger Sequencing

單位及作者：廣州呼吸疾病研究所和廣州醫科大學第一附屬醫院張潔霞主任團隊成員及相關研究人員。

發表期刊：YONSEI MED J

研究背景

肺癌是常見的胸部惡性腫瘤， EGFR基因突變率在高加索人群肺癌患者中為5-10％，在亞洲人非吸煙患者中為60-70%^[1]。與標準化療相比，EGFR敏感突變的NSCLC患者對EGFR抑制劑（包括吉非替尼和厄洛替尼）高度敏感。因此，EGFR突變的準確檢測對EGFR突變陽性非小細胞肺癌患者臨床管理中起著關鍵作用。

目前，檢測EGFR突變的方法包括Sanger測序，突變擴增系統（ARMS），焦磷酸測序，高分辨率熔解分析和高通量測序。Sanger測序仍然是臨床實踐中EGFR突變檢測的金標準，并且可以檢測到未知的EGFR突變。

研究目的

用Sanger測序法檢測ARMS-PCR方法未檢測到的潛在EGFR基因未知突變。

材料和方法

廣州醫科大學第一附屬醫院的200例樣本，包括用ARMS方法檢測的100例EGFR基因突變陰性樣本和100例EGFR突變陽性樣本。用Sanger測序進行檢測，分析兩種方法學和靈敏度以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療的結果。

提取：使用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒從福爾馬林固定的石蠟包埋的腫瘤組織中提取DNA。 再使用NanoDrop1000分光光度計測量其濃度（ng / mL）和吸光度（A260/ 280比率）后，將基因組DNA保存在-20±5℃。

Sanger測序：使用廣州立菲達安診斷產品技術有限公司EGFR突變檢測試劑盒進行擴增。 使用ABI 3100遺傳分析儀（AppliedBiosystems）進行測序和數據收集。

ARMS qPCR：使用ADx-ARMS EGFR 21檢測試劑盒檢測常見的EGFR突變。

結果及討論

1.   在100例ARMS陰性樣品中，三例通過Sanger方法檢測到突變呈陽性，并且確認了97例陰性樣品。

2.   ARMS方法檢測為陰性Sanger測序方法檢測為陽性的三例樣本突變情況為：c.2237_2251>TTC (complex)僅在cosmic的數據庫中報道了1次,c.2231_2232ins18 (insertion)在cosmic的數據庫中報道了6次, and c.2515G>A (substitution, position 2515, G→A)在數據庫中報道了4次。ARMS方法僅可以檢測外顯子18-21中的29個EGFR突變位點，該方法學因設計缺陷會漏檢。Sanger測序法檢測位點全面可以檢測未知和罕見突變。

3.   在EGFR-TKI治療方面，Sanger測序或ARMS檢測的EGFR陽性患者的中位PFS分別為11.1個月和10.9個月（95％CI，10.7-11.3月），這種差異并不顯著。高EGFR突變豐度患者PFS為12.4個月高于EGFR突變豐度低的患者（10.7-11.3月）。接受EGFR-TKIs的c.2237_2251>TTC突變患者或c.2231_2232ins18突變患者的PFS分別為3個月和6個月。EGFR-TKI治療4個月后，1例c.2515G> A突變患者失訪。

在EGFR突變非小細胞肺癌患者中，與EGFR野生型肺癌患者相比，EGFR-TKI治療顯著提高了生存率。EGFR突變位于外顯子18〜21，可作為EGFR-TKIs功效的預測因子。 因此，EGFR突變的檢測在非小細胞肺癌患者管理中起著關鍵作用。目前兩種主要的檢測方法是ARMS和Sanger測序。Sanger測序是金標準， ARMS僅限于檢測已知的突變。每個反應系統只能檢測到預先指定的基因突變。因此，如果必須分析未知區域，則需要大量樣本和重新設計引物對，使得該方法昂貴。Sanger測序可以以相對較低的成本分析未知的DNA序列。

研究結果表明，Sanger測序可推薦用于EGFR重新檢測和手術標本的初步檢測。我們確定EGFR-TKI治療后具有高EGFR突變豐度的患者具有更好的結果。根據以前的報道，EGFR突變豐度可以預測晚期NSCLC EGFR-TKI治療的結果。 因此，在臨床實踐中，Sanger測序為醫師提供了額外的信息，以預測患者是否可以從EGFR-TKI獲益。

     Sanger測序可以檢測罕見的EGFR突變，并且適用于重新確定EGFR突變情況。 具有高突變豐度的NSCLC患者對EGFR-TKI治療具有更好的效果。 需要更多臨床試驗來評估EGFR-TKIs在罕見EGFR突變患者中的療效。

原文鏈接：https://doi.org/10.3349/ymj.2018.59.1.13

部分參考文獻：

1.    Tan DS, Mok TS, Rebbeck TR. Cancer genomics: diversity and disparity across ethnicity and geography. J Clin Oncol 2016;34:91–101

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• CFDA注冊證：國械注準20153401069