新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種嚴重的急性呼吸道傳染性疾病，其由急性呼吸綜合征冠狀病毒SARS-CoV-2感染所致。自COVID-19新冠肺炎疫情爆發至今，已兩年有余。除了疫苗接種，目前醫學界還沒有針對治療新冠的特效藥問世。而關于其感染機制的研究，對于新冠藥物的研發至關重要。
 

據報導，SARS-CoV-2的感染需要許多受體和蛋白酶。在感染期間，SARS-CoV-2刺突（S）蛋白與細胞表面表達的血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合，并被跨膜蛋白酶絲氨酸2（TMPRSS2）等蛋白酶切割，導致S蛋白分裂為S1和S2結構域。SARS-CoV-2通過S2結構域融合和侵入細胞。因此，SARS-CoV-2感染被認為是依賴于宿主細胞中ACE2和TMPRSS2的表達。然而，除了ACE2和TMPRSS2之外的其他蛋白分子也在SARS-CoV-2感染中起著重要作用。
 

近期，有研究學者通過通過CRISPR/Cas9基因編輯系統和表達ACE2的人類誘導多能干細胞（iPS）檢測了神經纖毛蛋白-1（NRP1）、堿性蛋白BSG、跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS）和組織蛋白酶（CTS）在SARS-CoV-2感染中的作用。該研究發現雙重敲降TMPRSS2和組織蛋白酶B（CTSB）可將病毒載量降低至0.036%±0.021%。CTPB抑制劑CA-074甲酯和TMPRSS2抑制劑Camostat的組合更將病毒載量降低至0.0078%±0.0057%。這些研究結果都在四種SARS-CoV-2的變異株（β.1.3、β.1.1.7、β.1.351和β.1.1.248）中得到證實。同時使用這兩種藥物都可將人類男性和女性iPS中的病毒載量降低到0.01%以下。這些發現表明，對于TMPRSS2和CTSB的靶向化合物表現出高效的抗病毒效果，這可以為COVID-19的治療藥物研發提供一種思路。
 

為了闡明除ACE2以外的受體和蛋白酶在SARS-CoV-2感染中的功能，該研究通過使用過表達ACE2的iPS（ACE2 iPS）和CRISPRi系統抑制了BSG、CTSB和TMPRSS2基因的表達水平，并設計了針對這些基因的sgRNA。用表達sgRNAs、mKate2和抗病毒基因的質粒電轉染iPS，如下圖所示。

在比較通過dCas9蛋白表達抑制ACE2的iPS中目標基因的表達水平后，對細胞進行SARS-CoV-2感染，如下圖所示。

結果發現CTSL、CTSB和TMPRSS2的抑制使得ACE2 iPS中的病毒RNA拷貝數分別降低至11.7%±3.77%、0.84%±0.062%和20.6%±10.4%。TMRPSS2的抑制始終減少了刺突（S）蛋白的ACE2 iPS的數量。這些結果表明，CTSB、CTSL和TMPRSS2參與了ACE2 iPS的SARS-CoV-2感染。
 

基于上述發現，該研究團隊接下來探究了CTSB、CTSL和TMPRSS2抑制劑是否能抑制ACE2 iPS中的SARS-CoV-2感染。用SARS-CoV-2感染表達ACE2的iPS后，細胞在CA-074甲酯（CA-074 Me，CTSB抑制劑）、Z-Phe-Tyr（tBu）-重氮乙基酮（CTSL抑制劑）、卡莫司他（TMPRSS2抑制劑）或納法莫司他（TMPRSS2抑制劑）的存在下培養，如下圖所示。

最后，該研究團隊檢測了TMRPSS2和CTSB的雙重敲降機制對于ACE2 iPS的SARS-CoV-2感染的影響作用。結果發現，感染的CTSB和TMPRSS2雙基因敲降細胞中的病毒RNA拷貝數低于感染的單基因敲降細胞中的病毒RNA拷貝數，如下圖所示。

CRISPR/Cas9基因編輯系統可以使用轉錄阻遏物結構域（KRAB）和短引導RNA（sgRNA）融合的降解蛋白Cas9（dCas9）選擇性地抑制靶基因的表達。CRISPRi和iPS的組合可以將靶基因的表達抑制到1%或更低。此外，在由iPS誘導的體細胞中，該表達也保持低水平。到目前為止，利用iPS衍生的體細胞進行的SARS-CoV-2研究已得到廣泛開展。
 

值得一提的是，為了進行CRISPRi實驗，該研究團隊使用來自NEPA GENE的NEPA21高效基因轉染系統，并最終獲得了成功理想的實驗結果。

 

NEPA21高效基因轉染系統采用獨特設計的電轉程序，可應用細胞、離體組織或動物活體的轉染。配合獨有的電壓衰減（Voltage/Decay）設計，可在獲得高轉染效率的同時，提高細胞存活率。專門針對難轉染的原代免疫細胞、干細胞、神經細胞、活體動物、受精卵及宮內胚胎等轉染。目前已有眾多應用文獻發表在高水平學術期刊，是基因編輯、細胞免疫等前沿生物研究中的首選品牌！
 

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1. R Hashimoto, A Sakamoto, S Deguchi, R Yi, E Sano, A Hotta, K Takahashi, S Yamanaka, K Takayama. (2021). Dual inhibition of TMPRSS2 and Cathepsin B prevents SARS-CoV-2 infection in iPS cells, ScienceDirect, 26,1107-1114.

2. Seyran, M., Takayama, K., Uversky, V.N., Lundstrom, K., Palu, G., Sherchan, S.P., Attrish, D., Rezaei, N., Aljabali, A.A.A., Ghosh, S., et al. (2021). The structural basis of accelerated host cell entry by SARS-CoV-2y. FEBS J. 288, 5010–5020.

3. Daly, J.L., Simonetti, B., Klein, K., Chen, K.-E., Williamson, M.K., Antón-Plágaro, C., Shoemark, D.K., Simón-Gracia, L., Bauer, M., and Hollandi, R. (2020). Neuropilin-1 is a host factor for SARS-CoV-2 infection. Science 370, 861–865.

4. Cantuti-Castelvetri, L., Ojha, R., Pedro, L.D., Djannatian, M., Franz, J., Kuivanen, S., van der Meer, F., Kallio, K., Kaya, T., and Anastasina, M. (2020). Neuropilin-1 facil- itates SARS-CoV-2 cell entry and infectivity. Science 370, 856–860.

5. Wang, K., Chen, W., Zhang, Z., Deng, Y., Lian, J.-Q., Du, P., Wei, D., Zhang, Y., Sun, X.-X., and Gong, L. (2020). CD147-spike protein is a novel route for SARS-CoV-2 infection to host cells. Signal Transduct. Target. Ther. 5, 1–10