PCR簡介

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴增至足夠數量，以便進行結構和功能分析的一種反應。
 

PCR擴增原理

核酸降解是DNA/RNA分子中的堿基和戊糖間的氮糖苷鍵，或磷酸二酯鍵在物理因素、化學因素和生物因素等作用下發生水解，使DNA/RNA鏈發生斷裂。

▲ 圖一：PCR原理反應示意圖

▲ 圖二：PCR反應過程中溫度變化圖

實時熒光定量PCR原理

通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程，結合相應軟件可以對結果進行分析，通過標準曲線對未知模板進行定量分析，計算待測樣本的初始模板濃度。

▶  初始DNA濃度越高，熒光達到某一值（閾值）時所需要的循環數越少（Cq值）。

▶  Log濃度與循環數成線性關系，根據樣品擴增到閾值的循環數與已知起始拷貝數的標準品作出的標準曲線對比就可以計算出該樣品的起始拷貝數。

影響PCR擴增的因素

▶  模板間的交叉污染。

▶  PCR試劑的污染。

▶  PCR產物的污染。

防止污染的預防操作

❶ 永遠要設置NTC（No Template Control）對照，一個不含有模板DNA但含有PCR體系中所有其他成分的對照。如果不能在污染的第一時間發現，會導致后續一系列的數據無法使用。

❷ 準備PCR體系的移液器要專用，千萬不能用吸取過PCR產物的移液器去準備PCR體系。

❸ 打開離心管前先離心，開管動作要輕，以防管內液體濺出。

❹ 最好在加完其他反應成分再加入模板。

❺ 實驗結束后及時清理臺面。

出現污染后的解決辦法

❶ 更換試劑：更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用。

❷ 清潔所有可能的污染源：實驗臺面，離心機，門把手等。

❸ 實驗過程更加小心，采用前面提到的各種防止污染的方法。

Cielo^TM實時熒光定量PCR系統

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