CELL文章: Inscopix鈣成像揭示不同神經元類型和編碼認知行為的關系
美國斯坦福大學的駱利群課題組于2020年12月17日在Cell上發表了題為“Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classes across cognitive tasks”的文章，在這項研究中，作者研究特定轉錄類型的小鼠PFC神經元與軸突投射和編碼特性在多個認知任務中的關系，提出大多數神經元類型靶向多個靶點投射，且大多數靶點接受多種類型神經元的投射。通過使用滔博生物-Inscopix自由活動鈣成像顯微鏡發現在自由活動的小鼠中進行“二選一”任務測試時，這些神經元中存在的任務相關信號的多樣性。
圖1 前額葉皮層投射神經元
摘要
正文
為了確定轉錄組類型并揭示PFC區域基因表達的潛在差異，研究人員分析了背內側區（dmPFC）、腹內側區（vmPFC）和眶額區（OFC）。首先，將Rbp4Cre與在Cre+細胞中表達tdTomato的小鼠雜交，雙轉基因后代從出生后第34天到第40天分離組織，并運用SMART-Seq2對tdTomato+細胞進行熒光激發細胞分類（FACS）和基于平板（plate-based）的scRNA-seq，共分析了來自三個區域的3139個細胞的。隨后，用基于雜交鏈式反應的熒光原位雜交（HCR-FISH）檢查了PFC轉錄組類型之間標記表達的空間位置和共標狀況，發現dmPFC和vmPFC的轉錄組的空間相似，區分OFC的主要區別在于Pld5和Cxcr7（5-2）簇細胞的富集（圖2）。
圖2 Rbp4Cre標記的PFC投影神經元的轉錄組圖
為了研究vmPFC投射神經元的轉錄組類型與特定靶點之間的關系，研究人員對小鼠注射逆行Cre表達病毒，通過解剖含有逆行標記tdTomato+細胞的vmPFC并運行scRNA-seq后發現，大多數投射定義的細胞群體由多種轉錄組組成，且每個轉錄組類型共同投射到多個區域（圖3）。例如，97%以上的vmPFC→PAG神經元映射到Npr3簇，雖然將這些群體稱為“PAG投射”，但是，PAG并非特定靶點，即vmPFC→PAG神經元會將側支延伸到多個皮質下靶點。緊接著，對PAG或cPFC投射的tdTomato+神經元進行切片染色，對上述部分觀察結果進行驗證。結果顯示cPFC投射神經元與標記物Cd44、Cxcr7和Figf而不與Npr3共同標記，比例與測序數據中基本一致，相反的，PAG投射神經元與Npr3而非Figf高頻率共同標記。因此，這部分研究分別通過轉錄組和投射信號分析了不同的神經元群體。
接下來，研究人員對自由活動的小鼠實施“二選一（two-alternative forced choice, 2AFC）”任務，訓練小鼠在中心端口區分兩個氣味提示，當移至正確端口時獲取4μl水獎勵，移至錯誤端口則會導致短暫的吹氣處罰（圖4）。通過Inscopix頭戴式自由活動顯微鈣成像系統記錄分析單個細胞水平的神經活動來探索不同的vmPFC細胞類型如何對決策制定的功能做出貢獻（圖5），并通過光遺傳刺激皮層抑制神經元，使特定皮層區域沉默，測試vmPFC的神經活動對任務表現是否重要。研究人員在所有皮層GABA能抑制神經元中均表達ChR2的Gad2Cre；Ai32雙轉基因小鼠的vmPFC上方植入雙側光纖，結果顯示vmPFC對于2AFC任務的正確執行是必需的。
那么不同類型的vmPFC投射神經元如何編碼任務相關信號呢？研究人員將上述試驗任務定義為“Approach-Decision-Lick-Reward”四個階段，通過在Cre依賴的GCaMP6f小鼠中使用自由活動顯微鈣成像記錄以量化不同任務階段所有成像細胞的比例（圖5）。結果顯示60%-80%的細胞都至少在一個階段活性增高（圖6），例如，在“Decision”階段，與cPFC投射神經元相比，PAG投射神經元和Rbp4Cre標記的類別活化的細胞比例更高；相反，在“Reward”階段，與Rbp4Cre相比，PAG和cPFC投射神經元活化的細胞比例較低。值得注意的是，許多vmPFC細胞不僅對任務階段表現出活動選擇性，而且對左或右的方向也有選擇性，而對于方向選擇性PAG投射神經元中包含大多數特定于選擇方向的信息。
研究人員在原有試驗的基礎上進行改動，小鼠需要正確辨別出四種可能氣味來獲取獎勵，隨后會切換到無氣味提示任務，這也是本研究的關鍵特征，即對跨多個任務的行為編碼的探究。發現PAG投射神經元主要表示編碼氣味提示任務中的選擇性，但在切換到無提示任務時小鼠會花費數十秒迅速適應，而cPFC投射神經元則主要參與獎賞相關任務。這提示不同的細胞類型如何在不同的任務中發揮作用，并強調了在測試特定于細胞類型的編碼時具有多樣化的行為庫的重要性。
總的來說，這項工作通過scRNA-seq數據驅動對認知任務中編碼特性的分析，彌合了分子和系統神經科學間的重要鴻溝，進一步加深對PFC功能的理解，并推斷了任務信息如何在細胞類型框架中組織的原理。
參考文獻:
Jan H. Lui, Liqun Luo, et al. Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classese across cognitive tasks. Cell(2020)
關于滔博生物
滔博生物TOP-Bright是一家集研發、生產、銷售于一體的的高科技企業。我司專注于神經科學產品的研究且致力于向高校、科研機構等領域提供實驗室一體化方案，業務范圍遍布全國上百家實驗室。公司主營產品均為享譽全球的國際品牌, 這些儀器設備都是科學研究所必備且不可替代的。
目前公司主營產品是享譽全球的國際一線領導品牌，主要有：Inscopix自由活動超微顯微成像系統，Bruker多光子顯微鏡，功能神經外科電生理平臺，動物行為系統（自身給藥、條件恐懼、斯金納、睡眠剝奪、經典迷宮等），PiezoSleep無創睡眠檢測系統，NeuroNexus神經電極，電生理信號采集系統，膜片鉗系統，雙光子顯微鏡等。這些儀器設備都是科學研究所必備且不可替代的基礎儀器之一。
成像平臺：
1.Inscopix自由活動超微顯微成像系統
圖1 前額葉皮層投射神經元
摘要
單細胞轉錄組學已被廣泛應用于哺乳動物大腦中神經元的分類，而在早期的研究中，系統神經科學一直在沒有考慮細胞類型的情況下分析皮質神經元的編碼特性。研究人員對小鼠前額葉皮層（PFC）投影神經元的特定轉錄組類型如何與軸突投射和跨多個認知任務的編碼特性相關展開研究。發現，除了PFC→PAG（導水管灰色）外，大多數類型的投射到多個目標，并且大多數目標都從多個類型投射。通過使用Inscopix自由行為纖維鈣成像觀察PFC→PAG投射類型的Ca 2+活性與自由活動小鼠“二選一”任務中的兩種類型的比較，研究人員發現在所有檢查的類中定性存在與任務相關的信號。但是，投射PAG的神經元在提示任務中編碼選擇，而對側PFC投射的神經元在無提示任務中編碼獎賞預測。因此，任務相關信號存在多樣性，但是在具有特定分子解剖特征的細胞之間具有明顯的定量偏差。
正文
為了確定轉錄組類型并揭示PFC區域基因表達的潛在差異，研究人員分析了背內側區（dmPFC）、腹內側區（vmPFC）和眶額區（OFC）。首先，將Rbp4Cre與在Cre+細胞中表達tdTomato的小鼠雜交，雙轉基因后代從出生后第34天到第40天分離組織，并運用SMART-Seq2對tdTomato+細胞進行熒光激發細胞分類（FACS）和基于平板（plate-based）的scRNA-seq，共分析了來自三個區域的3139個細胞的。隨后，用基于雜交鏈式反應的熒光原位雜交（HCR-FISH）檢查了PFC轉錄組類型之間標記表達的空間位置和共標狀況，發現dmPFC和vmPFC的轉錄組的空間相似，區分OFC的主要區別在于Pld5和Cxcr7（5-2）簇細胞的富集（圖2）。
圖2 Rbp4Cre標記的PFC投影神經元的轉錄組圖
為了研究vmPFC投射神經元的轉錄組類型與特定靶點之間的關系，研究人員對小鼠注射逆行Cre表達病毒，通過解剖含有逆行標記tdTomato+細胞的vmPFC并運行scRNA-seq后發現，大多數投射定義的細胞群體由多種轉錄組組成，且每個轉錄組類型共同投射到多個區域（圖3）。例如，97%以上的vmPFC→PAG神經元映射到Npr3簇，雖然將這些群體稱為“PAG投射”，但是，PAG并非特定靶點，即vmPFC→PAG神經元會將側支延伸到多個皮質下靶點。緊接著，對PAG或cPFC投射的tdTomato+神經元進行切片染色，對上述部分觀察結果進行驗證。結果顯示cPFC投射神經元與標記物Cd44、Cxcr7和Figf而不與Npr3共同標記，比例與測序數據中基本一致，相反的，PAG投射神經元與Npr3而非Figf高頻率共同標記。因此，這部分研究分別通過轉錄組和投射信號分析了不同的神經元群體。
圖3 vmPFC轉錄組類型
接下來，研究人員對自由活動的小鼠實施“二選一（two-alternative forced choice, 2AFC）”任務，訓練小鼠在中心端口區分兩個氣味提示，當移至正確端口時獲取4μl水獎勵，移至錯誤端口則會導致短暫的吹氣處罰（圖4）。通過Inscopix頭戴式自由活動顯微鈣成像系統記錄分析單個細胞水平的神經活動來探索不同的vmPFC細胞類型如何對決策制定的功能做出貢獻（圖5），并通過光遺傳刺激皮層抑制神經元，使特定皮層區域沉默，測試vmPFC的神經活動對任務表現是否重要。研究人員在所有皮層GABA能抑制神經元中均表達ChR2的Gad2Cre；Ai32雙轉基因小鼠的vmPFC上方植入雙側光纖，結果顯示vmPFC對于2AFC任務的正確執行是必需的。
圖4 自由活動動物的2AFC任務
圖5 二選一任務中對vmPFC進行Inscopix顯微鈣成像
那么不同類型的vmPFC投射神經元如何編碼任務相關信號呢？研究人員將上述試驗任務定義為“Approach-Decision-Lick-Reward”四個階段，通過在Cre依賴的GCaMP6f小鼠中使用自由活動顯微鈣成像記錄以量化不同任務階段所有成像細胞的比例（圖5）。結果顯示60%-80%的細胞都至少在一個階段活性增高（圖6），例如，在“Decision”階段，與cPFC投射神經元相比，PAG投射神經元和Rbp4Cre標記的類別活化的細胞比例更高；相反，在“Reward”階段，與Rbp4Cre相比，PAG和cPFC投射神經元活化的細胞比例較低。值得注意的是，許多vmPFC細胞不僅對任務階段表現出活動選擇性，而且對左或右的方向也有選擇性，而對于方向選擇性PAG投射神經元中包含大多數特定于選擇方向的信息。
圖6 細胞類別之間不同時間的活性差異
研究人員在原有試驗的基礎上進行改動，小鼠需要正確辨別出四種可能氣味來獲取獎勵，隨后會切換到無氣味提示任務，這也是本研究的關鍵特征，即對跨多個任務的行為編碼的探究。發現PAG投射神經元主要表示編碼氣味提示任務中的選擇性，但在切換到無提示任務時小鼠會花費數十秒迅速適應，而cPFC投射神經元則主要參與獎賞相關任務。這提示不同的細胞類型如何在不同的任務中發揮作用，并強調了在測試特定于細胞類型的編碼時具有多樣化的行為庫的重要性。
總的來說，這項工作通過scRNA-seq數據驅動對認知任務中編碼特性的分析，彌合了分子和系統神經科學間的重要鴻溝，進一步加深對PFC功能的理解，并推斷了任務信息如何在細胞類型框架中組織的原理。
參考文獻:
Jan H. Lui, Liqun Luo, et al. Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classese across cognitive tasks. Cell(2020)
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關于滔博生物
滔博生物TOP-Bright是一家集研發、生產、銷售于一體的的高科技企業。我司專注于神經科學產品的研究且致力于向高校、科研機構等領域提供實驗室一體化方案，業務范圍遍布全國上百家實驗室。公司主營產品均為享譽全球的國際品牌, 這些儀器設備都是科學研究所必備且不可替代的。
目前公司主營產品是享譽全球的國際一線領導品牌，主要有：Inscopix自由活動超微顯微成像系統，Bruker多光子顯微鏡，功能神經外科電生理平臺，動物行為系統（自身給藥、條件恐懼、斯金納、睡眠剝奪、經典迷宮等），PiezoSleep無創睡眠檢測系統，NeuroNexus神經電極，電生理信號采集系統，膜片鉗系統，雙光子顯微鏡等。這些儀器設備都是科學研究所必備且不可替代的基礎儀器之一。
成像平臺：
1.Inscopix自由活動超微顯微成像系統
2.Bruker雙光子顯微鏡
3.Neurotar Mobile HomeCage 氣浮籠
3.Neurotar Mobile HomeCage 氣浮籠
動物行為學平臺：
1.PiezoSleep無創睡眠檢測系統
2.自身給藥、條件恐懼、斯金納、睡眠剝奪、跑步機、各類經典迷宮等
神經電生理：
1.NeuroNexus神經電極
2.多通道電生理信號采集系統
3.膜片鉗系統
科研/臨床級3D打印：
1.德國envisionTEC 3D Bioplotter生物打印機
2.韓國Invivo醫療級生物打印機等
1.PiezoSleep無創睡眠檢測系統
2.自身給藥、條件恐懼、斯金納、睡眠剝奪、跑步機、各類經典迷宮等
神經電生理：
1.NeuroNexus神經電極
2.多通道電生理信號采集系統
3.膜片鉗系統
科研/臨床級3D打印：
1.德國envisionTEC 3D Bioplotter生物打印機
2.韓國Invivo醫療級生物打印機等
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