導讀

盡管各國衛生系統發展迅速，但由病原菌引起的傳染病仍然是人類健康的主要威脅之一。據報道，全世界每年有220多萬人死于水傳播大腸桿菌病原體。盡管大多數大腸菌群是無害的，但某些大腸桿菌的存在可能會導致甚至威脅到人類健康，例如，大腸桿菌O157:H7和其他產志賀毒素的大腸桿菌菌株（非O157 STEC）是食源性疾病的常見因素，可能對健康造成嚴重后果，尤其是對幼兒。因此，檢測大腸桿菌對于生物醫學應用以及食品、水和空氣質量監測非常重要。

大連理工大學環境科學與技術學院，工業生態學與環境工程教育部重點實驗室的科學家，開發出基于naica^®全自動微滴芯片數字PCR系統的單細菌檢測方法，該方法可以在1.5小時內以單細胞靈敏度選擇性檢測臨床尿液樣本中的大腸桿菌 。該方法發表在《Analytical Methods》，題為“Single bacteria detection by droplet DNAzyme-coupled rolling circle amplification”。

應用亮點：

▶  dDRCA系統，能夠快速、選擇性地檢測具有單細胞敏感性的大腸桿菌 ，dDRCA系統的檢測靈敏度比之前報道的PAD高1000倍。

▶ 證明了dDRCA系統在尿路感染診斷中的潛在臨床適用性，dDRCA能夠在不到1.5小時內，從20份臨床尿液樣本中成功識別出5名UTI患者，而傳統的基于培養的方法需要數小時。

文中采用naica️^®全自動微滴芯片數字PCR系統液滴微流控技術，快速精準的檢測到復雜樣本和高背景樣本中的致病大腸桿菌。

通常擴增需要約4小時進行定量大腸桿菌檢測。在這項研究中，我們描述了DNA酶偶聯滾圈擴增（RCA），這是一種高效的等溫酶DNA復制過程，可在naica️^®全自動微滴芯片數字PCR系統上進行，以建立液滴DNA酶偶聯RCA（表示為dDRCA）系統。我們進一步證明，該系統能夠在1.5小時內以單細胞敏感性選擇性檢測臨床尿液樣本中的大腸桿菌。

▲圖2（a）通過瓊脂糖凝膠電泳分析RCA產物（RP）。（b） 反應混合物在指示反應條件下的熒光響應：+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (blue line);  RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (green line);  RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (red line); + RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (pink line)。（c） Naica Prism3閱讀器圖像（左）、CLSM圖像（中）和熒光顯微鏡圖像（右）為微晶芯片液滴的大小。比例尺：1.4 mm（左）和100 mm（中、右）。指示反應條件下dDRCA系統的熒光圖像和熒光滴數：（d）+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli;（e）-RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli; (f) -RFD-EC1/+ RDS/  E. coli; (g) + RFD-EC1/+ RDS/  E. coli.

使用Naica Prism3閱讀器對生成的熒光液滴進行成像和分析。dDRCA系統能夠在75分鐘內選擇性計數具有單細胞敏感性的大腸桿菌，包括20分鐘的細胞裂解時間、12分鐘的液滴生成時間和43分鐘的液滴反應時間。

通過比較其他三種常見細菌，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、酸性乳片球菌（P.acidilactici）和唐菖蒲伯克霍爾德菌（B.gladioli）存在時的信號反應，也檢查了dDRCA檢測大腸桿菌的選擇性。當用緩沖液或尿液中的這些意外靶點測試每個dDRCA系統時，未觀察到明顯的熒光液滴（圖4c和S4†）。

▲圖4（a）不同大腸桿菌濃度（每毫升細胞數）下dDRCA反應的熒光圖像。比例尺：1.4 mm。（b） 不同濃度下計數的液滴數與大腸桿菌之間的關系。提供了計數的液滴數量，插圖顯示了1–104大腸桿菌范圍內的線性反應。誤差條代表三個獨立實驗的標準偏差。（c） dDRCA的特異性。
 

最終證明了dDRCA系統在尿路感染（UTI）診斷中的潛在臨床適用性。分析了20份患者和健康獻血者的臨床尿樣。整個操作程序包括：（1）細胞收集和裂解（25分鐘）；（2） 液滴生成（12分鐘）；（3） 液滴反應（43分鐘）。如圖5c所示，五個尿樣，即ID 6、8、9、12和14，比其他尿樣產生大量熒光液滴（>3000）。使用傳統的大腸桿菌培養方法進一步確認了這些有無大腸桿菌感染的樣本（圖5d）。因此，對UTI的診斷有很大的希望。

▲圖5（a）檢測尿液樣本中的大腸桿菌。（b） 顯示尿液樣本中計數數與大腸桿菌細胞在1-10⁴范圍內的線性相關性的曲線圖。（c） 20份臨床尿液樣本中陽性液滴的數量。（d） CLED（胱氨酸、乳糖電解質缺乏）瓊脂細菌尿液培養板。黃色菌落代表大腸桿菌在37℃的CLED瓊脂中培養22小時后的生長。
 

該系統能夠在不到1.5小時的分析時間內，從20份臨床尿液樣本中成功識別出5名UTI患者，而傳統的基于培養的方法需要數小時。

原文：https://doi.org/10.1039/D2AY00656A

naica^®六通道數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道數字PCR系統，源于Crystal微滴芯片式數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數濃度。