Ampha Z32的應用：花粉作為外源基因媒介的小麥遺傳轉化
花粉使植物能夠通過異花受精轉移雄性配子，創造新的遺傳變異。受精、胚胎發生和種子發育的命運取決于花粉維持其活力的能力，以便將封閉的配子傳遞給等待的胚珠。由于花粉容易獲取，且在將遺傳物質傳遞給胚珠方面具有明確的作用，自19世紀以來，花粉一直被用作外源 DNA 的載體。花粉介導的遺傳轉化可以通過未成熟、發育中的花粉(稱為小孢子)或成熟的花粉粒來實現。利用成熟花粉粒的優點是，轉染后的花粉粒有直接用于胚珠受精產生轉基因后代的潛力；相比之下，小孢子的遺傳轉化則需要組織培養再生技術來產生雙單倍體轉基因植株。基于此，人們逐漸嘗試將花粉作為外來物質的載體進行不同作物的遺傳轉化的研究，如通過簡單的花粉照射和DNA-花粉的復合作用對玉米遺傳資源進行基因改良，就能夠獲得高達9.29%的轉化效率；但遺憾的是，不論是使用根癌農桿菌進行直接轉化，還是花粉作為DNA載體，均未能在小麥（Triticum aestivum L.）成熟花粉介導的基因改良中取得令人滿意的轉化效率，這是由于小麥復雜的基因組結構及其對花藥/組織培養技術的高度基因型特異性反應的限制。
通過質粒或CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)復合體轉染小麥花粉，如何在處理期間保持小麥花粉活力，是以花粉為基礎的小麥遺傳轉化的難點。本文中悉尼大學Mehwish Kanwal等人研究了七個不同小麥基因型的花粉形態（大小、形狀和孔徑）及其在一系列萌發培養基中的活力，以評估利用花粉作為外源基因媒介進行小麥遺傳轉化的可行性。
掃描電鏡（SEM）對花粉形態的檢測結果表明，七種小麥基因型的花粉均為單孔型，結構沒有顯著差異，但成熟花粉粒的大小和孔徑大小存在較大差異，其中小孔是花粉管萌發的位置，會促進了各種生理過程，包括擴散和內吞作用，有助于吸收外源性材料，這可能會影響外源物質(如質粒DNA、CRISPR RNPs)內化到水合花粉中的能力。
表1 基于掃描電子顯微鏡（SEM）的七種小麥基因型的花粉形態
*在每個小麥基因型的30粒花粉粒上記錄了花粉極軸長度（P）、花粉赤道軸長度（E）和孔徑的測量值。通過LSD檢驗，在p=0.05時，列中的相同字母表示無顯著性差異。
鑒于此前研究者所建立的小麥離體萌發培養基并不適用于本次研究中所使用的七種小麥基因型，Mehwish Kanwal等人在本次研究中對BK堿性萌發培養基進行了一系列改良，結果表明小麥花粉在含有5%蔗糖、10%PEG4000、100mg/L硼酸、200mg/L硝酸鈣、100mg/L硝酸鉀和100mg/L硫酸鎂的pH=6.5培養基中，在20±2℃下水合5小時后可達到了最高的萌發率。與此同時，本研究還利用Ampha Z32花粉活力分析儀(IFC，瑞士Amphasys)對七種小麥基因型的花粉活力進行同步檢測，結果表明IFC法與體外萌發法的結果之間具有強相關性(R2= 0.947)，IFC法明顯優于IKI染色法。
在本次研究的受控條件下儲存小麥花粉，可有效延長其活力長達5小時，并能在優化的培養基中成功發芽，這為進一步研究花粉作為外源基因媒介進行小麥遺傳轉化和基因編輯協議提供了重要的信息。
—— 原文 ——
Kanwal, M.; Gogoi, N.; Jones, B.; Bariana, H.; Bansal, U.; Ahmad, N. Pollen: A Potential Explant for Genetic Transformation in Wheat (Triticum aestivum L.). Agronomy 2022, 12, 2009.
由于相關研究內容非常專業，難免有些理解不準確或者編輯整理的疏漏，請以英文原文為準。
通過質粒或CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)復合體轉染小麥花粉，如何在處理期間保持小麥花粉活力，是以花粉為基礎的小麥遺傳轉化的難點。本文中悉尼大學Mehwish Kanwal等人研究了七個不同小麥基因型的花粉形態（大小、形狀和孔徑）及其在一系列萌發培養基中的活力，以評估利用花粉作為外源基因媒介進行小麥遺傳轉化的可行性。
圖1 本研究所用方法總體示意圖
縮寫：a，花藥；f、花絲；lo，漿片；p、 內稃/內穎；PGM，花粉萌發培養基；s、柱頭掃描電鏡（SEM）對花粉形態的檢測結果表明，七種小麥基因型的花粉均為單孔型，結構沒有顯著差異，但成熟花粉粒的大小和孔徑大小存在較大差異，其中小孔是花粉管萌發的位置，會促進了各種生理過程，包括擴散和內吞作用，有助于吸收外源性材料，這可能會影響外源物質(如質粒DNA、CRISPR RNPs)內化到水合花粉中的能力。
表1 基于掃描電子顯微鏡（SEM）的七種小麥基因型的花粉形態
圖2 掃描電鏡下的不同小麥基因型花粉粒
（A） 單孔小麥花粉粒；（B） Gladius+Sr50花粉的赤道面觀，顯示5µm的表面孔徑；（C）Thatcher花粉赤道面觀，顯示4µm孔徑；（D） Lilian花粉的略斜極面觀，孔徑為3µm；（E） 花粉在羽狀分枝柱頭表面萌發（用*表示）。鑒于此前研究者所建立的小麥離體萌發培養基并不適用于本次研究中所使用的七種小麥基因型，Mehwish Kanwal等人在本次研究中對BK堿性萌發培養基進行了一系列改良，結果表明小麥花粉在含有5%蔗糖、10%PEG4000、100mg/L硼酸、200mg/L硝酸鈣、100mg/L硝酸鉀和100mg/L硫酸鎂的pH=6.5培養基中，在20±2℃下水合5小時后可達到了最高的萌發率。與此同時，本研究還利用Ampha Z32花粉活力分析儀(IFC，瑞士Amphasys)對七種小麥基因型的花粉活力進行同步檢測，結果表明IFC法與體外萌發法的結果之間具有強相關性(R2= 0.947)，IFC法明顯優于IKI染色法。
圖3 幾種因素對Gladius+Sr50小麥品種萌發率（%）的影響
（a）不同pH值（LSD 0.05=8.49%）；（b） 不同濃度的硼酸（mg/L）（LSD 0.05=6.81%）；（c） 不同濃度的硝酸鈣（mg/L）（LSD 0.05=7.76%）。
圖4 體外萌發法（73.11±8.62%）與IFC法花粉活力（74.44±2.80%）檢測結果對比
在本次研究的受控條件下儲存小麥花粉，可有效延長其活力長達5小時，并能在優化的培養基中成功發芽，這為進一步研究花粉作為外源基因媒介進行小麥遺傳轉化和基因編輯協議提供了重要的信息。
—— 原文 ——
Kanwal, M.; Gogoi, N.; Jones, B.; Bariana, H.; Bansal, U.; Ahmad, N. Pollen: A Potential Explant for Genetic Transformation in Wheat (Triticum aestivum L.). Agronomy 2022, 12, 2009.
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