文獻解讀：DNA甲基化對橙、番茄、草莓果實成熟的重要作用

瀏覽次數：1070　發布日期：2023-2-28　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑多組學科研服務的易基因。本期我們通過3篇高分文章來聚焦DNA甲基化對果實成熟的重要作用。

01 橙果實發育

標題：Global increase in DNA methylation during orange fruit development and ripening（甜橙果實發育和成熟過程中全基因組DNA甲基化增加）
期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.
2021影響因子: 11.205
發表時間：2019.01
方法：WGBS、RNA-seq

摘要
DNA甲基化是參與許多生物過程的重要表觀遺傳標記。已有研究表明，番茄在成熟過程中全基因組DNA甲基化會顯著降低，但其他水果的成熟是否與全基因組DNA去甲基化有關還尚不清楚。作者鑒定了甜橙果實的單堿基分辨DNA甲基化情況。與未成熟的甜橙果實相比，成熟的甜橙果實在3萬多個基因組區域獲得了DNA甲基化，在大約1000個基因組區域失去DNA甲基化，這表明在甜橙果實成熟過程中全基因組DNA甲基化顯著增加。DNA甲基化的增加與DNA去甲基酶基因表達的降低有關。DNA甲基化抑制劑的應用干擾了甜橙果實的成熟，這表明DNA高甲基化是甜橙果實能夠正常成熟的關鍵。作者發現，成熟相關的DNA高甲基化與數百個基因(如光合作用基因)的抑制和數百個基因(包括與脫落酸反應有關的基因)的激活有關。作者的結果表明DNA甲基化在甜橙果實成熟過程中起著重要作用。

材料
紐荷爾甜橙(Citrus Sinensis Osbeck)果實，采集了開花后90、120、150、180和210d的五個不同發育階段的果實。采集橙果皮，并保存在−80°C，用于DNA和RNA的提取。

結果
為了研究甜橙果實發育過程中DNA甲基化的動態變化，作者根據甜橙果實發育和成熟的時間，將果實分為開花后90d、120d、150d、180d和210d五個不同的階段(以下簡稱CS1∼CS5)進行單堿基分辨的全基因組DNA甲基化分析(圖1A)。

作者發現DNA甲基化的增加主要是由于CHH甲基化的增加(圖1B)。為了研究未成熟與成熟水果間的差異，作者比較了CS1和CS5兩個階段的DNA甲基化情況。如圖1C所示，主成分分析(PCA)顯示在每個階段兩個生物學重復具有很好的一致性。作者發現CS5中相對于CS1總共有120萬個DMC，其中88%是高甲基化(hyper-DMC)，并且93%的高甲基化發生在CHH背景下，這表明CHH DNA甲基化主要從CS1增加到CS5(圖1D)。

圖1

由于在擬南芥、水稻胚乳、番茄發育過程中，整體的低甲基化會伴隨著局部的高甲基化。作者想知道在橙子成熟過程中是否也存在同樣的現象。進一步研究表明橙子果實成熟過程中CHH的高甲基化并不伴隨CG的低甲基化(圖2)。而且甜橙果實發育和成熟期間全基因組DNA甲基化增加，與番茄果實成熟期間全基因組DNA甲基化減少形成鮮明對比。

圖2

DNA甲基化狀態可由DNA甲基轉移酶和DNA去甲基酶活性動態調節。甜橙果實發育成熟過程中DNA甲基化增加可能是由于DNA甲基轉移酶活性增強或DNA脫甲基酶活性降低所致。為了研究這些可能性，作者檢測了DNA甲基轉移酶和脫甲基酶基因在甜橙果實發育和成熟不同階段的表達水平。結果表明，成熟過程DNA脫甲基酶基因表達減少可能是引起DNA甲基化增加的原因(圖3)。

圖3

通過對DNA高甲基化相關基因分析，作者發現數百個基因啟動子區域的甲基化與基因表達的陽性和陰性變化均有關聯，分析表明：參與光合作用、細胞壁維持和發育的基因下調；脫落酸信號傳導（對成熟很重要）以及類固醇和芳香族代謝相關基因的上調。并且將DNA甲基化抑制劑注射到甜橙果皮中可以阻止橙子脫綠（成熟）(圖4)。

圖4

02 番茄果實發育

標題：Critical roles of DNA demethylation in the activation of ripening-induced genes and inhibition of ripening-repressed genes in tomato fruit（DNA去甲基化在番茄果實成熟誘導基因激活和成熟抑制基因抑制中的關鍵作用）

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.
2021影響因子: 11.205
發表時間：2017.05
方法：CRISPR/Cas 9、WGBS、RNA-seq

摘要
DNA甲基化是一種保守的表觀遺傳標記，對植物和哺乳動物基因組的完整性、發育和環境反應非常重要。植物中活躍的DNA去甲基化是由一系列5-mC DNA糖基化酶/裂解酶(即DNA去甲基酶)啟動的。最近的報道表明，活躍的DNA去甲基化在番茄果實成熟過程中起著重要作用。在本研究中，作者獲得了番茄基因SlDML2的功能缺失突變體，該基因與擬南芥DNA去甲基酶基因ROS1同源。在番茄突變體的果實中，發現數千個基因的DNA甲基化增加。這些基因不僅包括數百個成熟誘導基因，還包括許多成熟抑制基因。作者的結果表明SlDML2在番茄果實成熟過程中起著關鍵作用，成熟誘導基因的激活和成熟抑制基因的抑制都需要活躍的DNA去甲基化。

材料
本研究所用植物材料均為第一代(T0)愈傷組織再生植株。所有的組織培養步驟都是在室溫下進行的，光周期為16h光照，8h黑暗。

結果
作者利用CRISPR/Cas 9技術獲得了番茄sldml2突變體，與WT植株的果實成熟相比，sldml2突變體的果實成熟明顯受到抑制(圖1)。

圖1

在sldml2突變體中，高DMR的數量遠遠高于低DMR的數量，這與推測SlDML2在DNA去甲基化中的功能是一致的。為了研究SlDML2在DNA去甲基化中的作用，作者重點研究了sldml2突變體中的高DMR(圖2)。SlDML2基因與擬南芥中的DNA去甲基化酶基因ROS1高度同源。

圖2

作者分析了番茄品種果實成熟過程中DNA甲基化的變化，通過對比野生型與突變體間成熟過程中的差異甲基化區域（高甲基化、低甲基化區域），發現SlDML2是果實成熟誘導的DNA去甲基化所必需的(圖3)。由于該基因的失活，使得全基因組范圍內的甲基化水平升高，誘導果實成熟的基因表達受到抑制，導致番茄果實不能正常成熟。

圖3

進一步研究表明，SlDML2 參與了色素合成、口味形成、乙烯生物合成及信號傳導途徑、細胞壁水解等調節機制，還參與調控了成熟相關基因的表達。另外，作者還發現，SlDML2介導的DNA去甲基化也抑制了部分參與光合作用及細胞壁合成的基因表達，這些基因大多是果實成熟所不需要的。

03 草莓果實發育

標題：Downregulation of RdDM during strawberry fruit ripening（草莓果實成熟過程中RdDM的下調）

期刊：Genome biology
2021影響因子: 13.583
發表時間：2018.12
方法：MS-PCR、WGBS、RNA-seq、sRNA-seq、VIGS

背景
近年來，DNA甲基化被多項研究證實與調控肉質果實的成熟有關。肉質水果可以根據其成熟過程區分為躍變期水果，如西紅柿；或非躍變期水果，如草莓。由于DNA脫甲基酶基因的表達增加，番茄在成熟過程中DNA甲基化水平整體下降。但非躍變期果實成熟過程中DNA甲基化的變化情況和生物學相關性尚不清楚。

材料
草莓(Fragaria × ananassa Duch. cv. Hongjia)是在浙江省農業科學院海寧科研創新基地種植的。收獲了三個發育階段的果實(Fa1，綠色期，開花后約20天(DAB)；Fa2，中間紅期，30DAB；Fa3，全紅期，35DAB)。在收獲當天轉移到實驗室后，選擇了大小均勻、沒有明顯缺陷的果實。每個發育階段使用兩個生物重復，每個重復8-12個果實。

結果
作者整合了未成熟和成熟時期草莓全基因組DNA甲基化分析結果，觀察到草莓果實成熟過程中DNA甲基化會整體下調(圖1、2)，因此，成熟誘導的DNA低甲基化不僅發生在躍變型果實中，也發生在非躍變型果實中。