基于cfDNA甲基化的腫瘤液體活檢開展步驟
液體活檢是指通過微創或無創的方式收集血液或其他體液（包括尿液、腹水、胸腔積液等），并對其中腫瘤相關的物質進行分析的一種檢驗方式。以血液為例，除了正常的紅細胞、白細胞、來自正常細胞的游離 DNA (cell free DNA, cfDNA)，還可以檢測到一些來自腫瘤的物質，包括循環腫瘤細胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)、循環腫瘤 DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)。需要指出的是，cfDNA 可以來自正常細胞和腫瘤細胞，ctDNA 特指來自腫瘤的游離 DNA。
液體活檢，特別是對cfDNA的分析，已經成為腫瘤學中一種具有廣闊應用前景的非侵入性診斷方法。ctDNA甲基化可在腫瘤發生的早期被檢測到，而且具有較好的穩定性，因此ctDNA甲基化成為腫瘤液體活檢中一個極具價值的標志物。目前正在開發cfDNA甲基化圖譜的系統分析，用于癌癥的早期發現、微小殘留病(MRD)的監測、預測治療效果和預后、追蹤組織來源等。本文綜述了ctDNA圖譜在早期癌癥非侵入性診斷中的優缺點，并探討了ctDNA甲基化檢測在臨床應用中的最新進展。還總結了用于ctDNA甲基化分析的技術，并簡要概述了用于分析DNA甲基化測序數據的生物信息學方法。
下面將從cfDNA和ctDNA的基本概念、ctDNA甲基化檢測技術、DNA甲基化數據分析模式以及ctDNA甲基化的臨床應用這四個方面進行簡要概述。
1.什么是cfDNA和ctDNA？
cfDNA（cell free DNA）是指細胞游離DNA，通過細胞凋亡、壞死和分泌釋放到血液中(圖1)。cfDNA通常是雙鏈片段，長度約為150-200個堿基對。ctDNA的分子遺傳和表觀遺傳信息可以反映出起源細胞的基因組或表觀基因組。健康成年人的cfDNA濃度一般很低，通常不到每毫升血漿10微克。
在癌癥患者中，總cfDNA的某些成分是由腫瘤細胞釋放的，稱為ctDNA (Circulating Tumor DNA)。ctDNA在整個cfDNA背景中的比例變化很大，從0.05%到90%不等。影響ctDNA濃度的因素很多，包括腫瘤的體積、定位和血運、抗腫瘤治療(如手術、化療、放療等)，以及肝和腎的清除作用。據報道，ctDNA的半衰期為16分鐘到2.5小時，這使得ctDNA分析可以作為腫瘤情況的“實時快照”。ctDNA在膀胱癌、結直腸癌和卵巢癌等癌癥類型中幾乎可以100%被檢測到，并且在其他大多數癌癥類型中也有超過50%的概率可以被檢測到，不過在膠質瘤中只有10%的病例中可以檢測到ctDNA。同時，血漿中ctDNA濃度和可檢測到ctDNA水平也被證明與腫瘤分期有關。
2.ctDNA甲基化檢測技術
在將ctDNA甲基化分析應用于臨床之前，需要解決的關鍵問題之一是檢測技術，它必須具有高靈敏度、成本效益和測序覆蓋率高的特點，特別是對于非常微量的ctDNA。目前，已經開發了許多檢測ctDNA甲基化的方法(圖2)，大致可分為兩類：基于重亞硫酸鹽轉化的方法和非重亞硫酸鹽轉化方法。表1選擇性地列出了當前主要檢測方法的優缺點和對cfDNA起始量的需求。
其中，重亞硫酸鹽轉化方法可以分為基因組甲基化檢測，代表性的方法包括全基因組甲基化測序（WGBS）和簡化基因組甲基化測序（RRBS等）。如果要檢測特定位點的甲基化，還可以使用靶基因重壓硫酸鹽測序（Target-BS）、焦磷酸測序、甲基化芯片和甲基化特異性PCR(MSP)。而不依賴于重亞硫酸鹽轉化的方法又可以分為基于富集的方法和基于限制性內切酶的方法。表1列出了當前主要檢測方法的優缺點以及對cfDNA起始量的需求。
表1.液體活檢的主要甲基化檢測方法
3.DNA甲基化數據分析模式
ctDNA技術的最新發展側重于提高測序方法的分析靈敏度，這可能會受到DNA制備過程中或測序過程中引入的錯誤的影響。ctDNA甲基化與常規數據分析在分析策略上沒有明顯差異。對于基于NGS的方法，分析程序包括質量控制(QC)、數據比對、DNA甲基化位點/甲基化峰確認、DNA甲基化定量和差異甲基化位點/區域(DMS/DMR)鑒定。結合測序文庫的準備，每種測量方法對應的分析細節在某些步驟上是不同的，下面介紹常用的分析程序：
質量控制(QC)和數據比對：即對數據進行質量控制，保留高質量的數據，并將質控后的數據與人類參考基因組進行比對。
定量DNA甲基化位點/峰：對于亞硫酸氫鹽測序方法，甲基化位點由比對中未改變的C位點決定，獲得的每個CpG位點的甲基化水平是一個連續變量，通過使用未甲基化的C在測序的總C中的比例來計算。
差異甲基化位點/區域(DMS/DMR)鑒定：在進行回歸分析時，可以添加協變量校正以消除混雜因素的影響，如年齡和性別。在小樣本量的情況下，多個相鄰的CpG位點應合并到一個定義的區域，稱為DMR，以提高統計性能。
癌癥特異性cfDNA甲基化生物標志物的鑒定：通常的步驟是(i)獲得癌癥和健康cfDNA之間的DMRs；(ii)獲得癌癥cfDNA和外周血單核細胞(PBMC)基因組DNA的DMRs；(iii)前述DMRs的共有區域為腫瘤特異性DMRs，同時將無腫瘤PBMC的甲基化譜作為陰性對照。
4. ctDNA甲基化的臨床應用場景
ctDNA甲基化在精確腫瘤學中的臨床應用場景主要有以下幾個方面：
癌癥篩查：篩查疾病標志物，以便對無癥狀個體的癌癥進行早期干預。
癌癥檢測：癌癥的早期檢測可以使治療盡早開始。如果腫瘤被早期診斷，可以進行根治性手術，以提高患者的治愈率。對于有癥狀的患者，靈敏而特異的癌癥檢測可以加快診斷和治療的時間。
微小殘留病和復發監測：識別復發風險高的殘留病患者，這可用于在接受輔助治療之前對患者進行分級。有效的分級將防止低風險患者過度治療，防止高危患者治療不足。MRD可以比目前的方法提前幾個月預測復發。
評估治療效果：ctDNA動態與治療反應相關，能夠在臨床復發前提示治療效果。治療監測可以確定反應或進展，使臨床醫生和患者能夠相應地選擇治療方案。
預后價值：對進展風險的評估對于治療策略的選擇至關重要。
追蹤ctDNA的組織來源：確定cfDNA的組織來源具有重大的生物學意義和潛在診斷價值。
下表列舉了近期基于DNA甲基化的癌癥液體活檢研究的部分綜述，感興趣的小伙伴也可檢索文獻閱讀。
總體而言，ctDNA 甲基化是腫瘤早期或復發早期的重要信號，檢測體液中的ctDNA 甲基化對于腫瘤的篩查、早期診斷、預后判斷、復發檢測、療效評估等關鍵難題極具應用價值。
參考文獻：https://doi.org/10.1016/j.molmed.2020.12.01
液體活檢，特別是對cfDNA的分析，已經成為腫瘤學中一種具有廣闊應用前景的非侵入性診斷方法。ctDNA甲基化可在腫瘤發生的早期被檢測到，而且具有較好的穩定性，因此ctDNA甲基化成為腫瘤液體活檢中一個極具價值的標志物。目前正在開發cfDNA甲基化圖譜的系統分析，用于癌癥的早期發現、微小殘留病(MRD)的監測、預測治療效果和預后、追蹤組織來源等。本文綜述了ctDNA圖譜在早期癌癥非侵入性診斷中的優缺點，并探討了ctDNA甲基化檢測在臨床應用中的最新進展。還總結了用于ctDNA甲基化分析的技術，并簡要概述了用于分析DNA甲基化測序數據的生物信息學方法。
下面將從cfDNA和ctDNA的基本概念、ctDNA甲基化檢測技術、DNA甲基化數據分析模式以及ctDNA甲基化的臨床應用這四個方面進行簡要概述。
1.什么是cfDNA和ctDNA？
cfDNA（cell free DNA）是指細胞游離DNA，通過細胞凋亡、壞死和分泌釋放到血液中(圖1)。cfDNA通常是雙鏈片段，長度約為150-200個堿基對。ctDNA的分子遺傳和表觀遺傳信息可以反映出起源細胞的基因組或表觀基因組。健康成年人的cfDNA濃度一般很低，通常不到每毫升血漿10微克。
在癌癥患者中，總cfDNA的某些成分是由腫瘤細胞釋放的，稱為ctDNA (Circulating Tumor DNA)。ctDNA在整個cfDNA背景中的比例變化很大，從0.05%到90%不等。影響ctDNA濃度的因素很多，包括腫瘤的體積、定位和血運、抗腫瘤治療(如手術、化療、放療等)，以及肝和腎的清除作用。據報道，ctDNA的半衰期為16分鐘到2.5小時，這使得ctDNA分析可以作為腫瘤情況的“實時快照”。ctDNA在膀胱癌、結直腸癌和卵巢癌等癌癥類型中幾乎可以100%被檢測到，并且在其他大多數癌癥類型中也有超過50%的概率可以被檢測到，不過在膠質瘤中只有10%的病例中可以檢測到ctDNA。同時，血漿中ctDNA濃度和可檢測到ctDNA水平也被證明與腫瘤分期有關。
圖1
2.ctDNA甲基化檢測技術
在將ctDNA甲基化分析應用于臨床之前，需要解決的關鍵問題之一是檢測技術，它必須具有高靈敏度、成本效益和測序覆蓋率高的特點，特別是對于非常微量的ctDNA。目前，已經開發了許多檢測ctDNA甲基化的方法(圖2)，大致可分為兩類：基于重亞硫酸鹽轉化的方法和非重亞硫酸鹽轉化方法。表1選擇性地列出了當前主要檢測方法的優缺點和對cfDNA起始量的需求。
圖2
其中，重亞硫酸鹽轉化方法可以分為基因組甲基化檢測，代表性的方法包括全基因組甲基化測序（WGBS）和簡化基因組甲基化測序（RRBS等）。如果要檢測特定位點的甲基化，還可以使用靶基因重壓硫酸鹽測序（Target-BS）、焦磷酸測序、甲基化芯片和甲基化特異性PCR(MSP)。而不依賴于重亞硫酸鹽轉化的方法又可以分為基于富集的方法和基于限制性內切酶的方法。表1列出了當前主要檢測方法的優缺點以及對cfDNA起始量的需求。
表1.液體活檢的主要甲基化檢測方法
3.DNA甲基化數據分析模式
ctDNA技術的最新發展側重于提高測序方法的分析靈敏度，這可能會受到DNA制備過程中或測序過程中引入的錯誤的影響。ctDNA甲基化與常規數據分析在分析策略上沒有明顯差異。對于基于NGS的方法，分析程序包括質量控制(QC)、數據比對、DNA甲基化位點/甲基化峰確認、DNA甲基化定量和差異甲基化位點/區域(DMS/DMR)鑒定。結合測序文庫的準備，每種測量方法對應的分析細節在某些步驟上是不同的，下面介紹常用的分析程序：
質量控制(QC)和數據比對：即對數據進行質量控制，保留高質量的數據，并將質控后的數據與人類參考基因組進行比對。
定量DNA甲基化位點/峰：對于亞硫酸氫鹽測序方法，甲基化位點由比對中未改變的C位點決定，獲得的每個CpG位點的甲基化水平是一個連續變量，通過使用未甲基化的C在測序的總C中的比例來計算。
差異甲基化位點/區域(DMS/DMR)鑒定：在進行回歸分析時，可以添加協變量校正以消除混雜因素的影響，如年齡和性別。在小樣本量的情況下，多個相鄰的CpG位點應合并到一個定義的區域，稱為DMR，以提高統計性能。
癌癥特異性cfDNA甲基化生物標志物的鑒定：通常的步驟是(i)獲得癌癥和健康cfDNA之間的DMRs；(ii)獲得癌癥cfDNA和外周血單核細胞(PBMC)基因組DNA的DMRs；(iii)前述DMRs的共有區域為腫瘤特異性DMRs，同時將無腫瘤PBMC的甲基化譜作為陰性對照。
4. ctDNA甲基化的臨床應用場景
ctDNA甲基化在精確腫瘤學中的臨床應用場景主要有以下幾個方面：
癌癥篩查：篩查疾病標志物，以便對無癥狀個體的癌癥進行早期干預。
癌癥檢測：癌癥的早期檢測可以使治療盡早開始。如果腫瘤被早期診斷，可以進行根治性手術，以提高患者的治愈率。對于有癥狀的患者，靈敏而特異的癌癥檢測可以加快診斷和治療的時間。
微小殘留病和復發監測：識別復發風險高的殘留病患者，這可用于在接受輔助治療之前對患者進行分級。有效的分級將防止低風險患者過度治療，防止高危患者治療不足。MRD可以比目前的方法提前幾個月預測復發。
評估治療效果：ctDNA動態與治療反應相關，能夠在臨床復發前提示治療效果。治療監測可以確定反應或進展，使臨床醫生和患者能夠相應地選擇治療方案。
預后價值：對進展風險的評估對于治療策略的選擇至關重要。
追蹤ctDNA的組織來源：確定cfDNA的組織來源具有重大的生物學意義和潛在診斷價值。
下表列舉了近期基于DNA甲基化的癌癥液體活檢研究的部分綜述，感興趣的小伙伴也可檢索文獻閱讀。
總體而言，ctDNA 甲基化是腫瘤早期或復發早期的重要信號，檢測體液中的ctDNA 甲基化對于腫瘤的篩查、早期診斷、預后判斷、復發檢測、療效評估等關鍵難題極具應用價值。
參考文獻：https://doi.org/10.1016/j.molmed.2020.12.01
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