Xenium原位分析技術助力發現罕見的癌癥生物學特征
在您試圖了解腫瘤侵襲性的差異時，很容易錯過那些隱藏在復雜腫瘤微環境中的微小異質性，比如上圖乳腺癌樣本中的一小塊三陽性區域。在這篇文章中，我們將講述Xenium原位分析技術如何發現這種被其他方法遺漏的獨特的癌癥生物學特征。
兩個看似相同的腫瘤
一個腫瘤是非侵襲性的，相對無害
另一個卻逐漸形成侵襲性，變成有害的侵襲性腫瘤
為什么？
答案很簡單：異質性，但異質性本身卻并不簡單...
盡管癌癥是最臭名昭著的例子，但患者之間和患者自身的異質性是所有疾病面臨的難題。事實上，即使在健康狀態下，絕大多數的人類生物學功能的正常行使也需要細胞異質性。
細胞異質性的評估因幾方面的挑戰而變得復雜。首先，小的分子波動可能導致大的功能變化(1)。其次，基因組水平的異質性可能不會轉化到轉錄組、蛋白質組或結構水平，反之亦然(2)。此外，空間背景會大大影響異質性。
異質性很難用傳統方法來解析，但在將單細胞數據的強大分辨率與空間轉錄組數據提供的形態學背景相整合后，研究人員在捕捉這種復雜生物學現象的驅動因素方面取得了很大進展。這種方法計算量大，仍然依賴于推斷而不是直接觀察。盡管這些整體轉錄組分析對科學探索很有幫助，但仍需要深入研究這些方法所發現的感興趣基因，才能真正了解其意義。
那么，如果有一種方法能夠將單細胞分辨率的力量與空間基因表達的形態學背景融合到單個實驗中，又會怎么樣？
想象一下，您是一名研究人員，上圖這份導管原位癌（DCIS）樣本正出現在您的工作臺上，并有機會采用Xenium原位分析。您會在分析中發現什么？
根據H&E染色后的傳統組織病理學評估，這份乳腺腫塊粗針穿刺活檢樣本被注釋為HER2+/ER+/PR- (4)。也就是說，這份樣本表達人類表皮生長因子受體2（HER2/ERBB2）和雌激素受體（ER/ESR1），但不表達孕酮受體（PR/PGR）。
為了生成亞細胞分辨率的基因表達圖譜，我們采用高度特異且靈敏的可環化鎖式探針來檢測感興趣的RNA轉錄本。這個樣本經過10x Genomics公司Xenium人類乳腺基因表達panel（包含313個基因的探針）處理，反映了以往在單細胞圖譜數據中描述的致瘤和健康人類乳腺組織的狀態(5-7)。
根據H&E染色后的傳統組織病理學評估，這份乳腺腫塊粗針穿刺活檢樣本被注釋為HER2+/ER+/PR- (4)。也就是說，這份樣本表達人類表皮生長因子受體2（HER2/ERBB2）和雌激素受體（ER/ESR1），但不表達孕酮受體（PR/PGR）。
為了生成亞細胞分辨率的基因表達圖譜，我們采用高度特異且靈敏的可環化鎖式探針來檢測感興趣的RNA轉錄本。這個樣本經過10x Genomics公司Xenium人類乳腺基因表達panel（包含313個基因的探針）處理，反映了以往在單細胞圖譜數據中描述的致瘤和健康人類乳腺組織的狀態(5-7)。
回顧圖2A所示的Xenium空間結果中的ESR1、ERBB2和PGR表達，發現所分析的組織切片的大部分區域同時表達ERBB2和ESR1轉錄本（HER2/ER雙陽性），或只表達ERBB2轉錄本（HER2陽性）。
然而，Xenium也發現了一小塊區域，大約5.5 mm x 7.5 mm，呈現出ERBB2、ESR1和PGR轉錄本的三陽性表達（HER2+/ER+/PR+；圖2A-D）。考慮到受體狀態可用來預測患者預后和選擇治療策略(8-9)，鑒定這個獨特的三陽性區域的能力有多重要，相信已經不言而喻。
為了全面研究組織生物學，Xenium原位分析將強大的單分子RNA測序與空間解碼技術相結合，能夠以亞細胞分辨率快速檢測整張組織切片中的數百個至數千個RNA靶點。這種類型的分析不僅能在生物學背景下對細胞進行定位和分型，還能解決細胞間通訊的問題，分析細胞微環境并鑒定罕見的細胞浸潤。
Xenium通過獨特的四因素認證化學方法，帶來了高特異性。每個靶點都是利用掛鎖式探針鑒定的。
然而，Xenium也發現了一小塊區域，大約5.5 mm x 7.5 mm，呈現出ERBB2、ESR1和PGR轉錄本的三陽性表達（HER2+/ER+/PR+；圖2A-D）。考慮到受體狀態可用來預測患者預后和選擇治療策略(8-9)，鑒定這個獨特的三陽性區域的能力有多重要，相信已經不言而喻。
為了全面研究組織生物學，Xenium原位分析將強大的單分子RNA測序與空間解碼技術相結合，能夠以亞細胞分辨率快速檢測整張組織切片中的數百個至數千個RNA靶點。這種類型的分析不僅能在生物學背景下對細胞進行定位和分型，還能解決細胞間通訊的問題，分析細胞微環境并鑒定罕見的細胞浸潤。
Xenium通過獨特的四因素認證化學方法，帶來了高特異性。每個靶點都是利用掛鎖式探針鑒定的。
兩條臂與靶點穩定雜交（第1步和第2步）
探針末端彼此連接，形成一個環狀探針（第3步）
成功完成這個環狀探針的滾環擴增（第4步）
這種方法的靈敏度很高，足以區分高同源性的RNA，并檢測低表達的轉錄本。Xenium高靈敏度的化學方法與亞細胞空間分辨率的組合對于這種三陽性區域的檢測至關重要。
在檢測過程中，熒光標記的探針自動進入循環、孵育、成像，并被儀器去除。在儀器運行結束后，數據即被整合，建立起整張組織切片的轉錄本空間圖譜。
Xenium對整張組織切片的高分辨率分析是促成這個（三陽性）區域被鑒定出的另一個重要因素。在此次分析中，三陽性區域大約只有0.1 mm2，而總面積為42 mm2。這個稀疏的區域對非靶向或低分辨率方法來說是一大挑戰。此外，由于一些空間技術只能對實驗前預先選擇的感興趣區域進行分析，那么這個小區域就很容易被忽略，因為以往沒有辦法知道它包含獨特的生物學特征。
對這張切片的詳細分析揭示出三個不同的腫瘤亞型，其細胞微環境有著顯著差異（圖3）。對于整張切片的高度異質性活檢，Xenium能夠提供高質量的數據，表明它有能力應對富有挑戰性的組織類型。
Xenium原位分析的另一個強大優勢在于它能夠在Xenium運行后對同一組織切片進行免疫熒光染色（圖4）。這種功能之所以能夠實現，是因為儀器上非破壞性的生化和解碼循環保留了蛋白質表位。盡管一些空間技術能夠提供RNA和蛋白表達的分析，但其中許多需要使用連續的載玻片來分析不同的分析物類型，這使得分析物無法同時實現大規模可視化。在Xenium處理過程中，組織的完整性得以保留，這意味著在Xenium處理后也可以進行H&E染色（圖2C）。獲得同一張組織切片的組織病理學、蛋白表達和基因表達數據，可幫助您更全面地了解樣本的生物學特征。
在探究腫瘤是否會繼續保持良性還是轉變成侵襲性這樣的復雜生物學問題時，大海撈針有時似乎比破譯癌癥背后的分子機制要簡單一些。然而，每一個新的生物學機制都有可能改變我們診斷和治療癌癥的方式，甚至在某一天還能治愈癌癥。
參考資料：
Xenium對整張組織切片的高分辨率分析是促成這個（三陽性）區域被鑒定出的另一個重要因素。在此次分析中，三陽性區域大約只有0.1 mm2，而總面積為42 mm2。這個稀疏的區域對非靶向或低分辨率方法來說是一大挑戰。此外，由于一些空間技術只能對實驗前預先選擇的感興趣區域進行分析，那么這個小區域就很容易被忽略，因為以往沒有辦法知道它包含獨特的生物學特征。
對這張切片的詳細分析揭示出三個不同的腫瘤亞型，其細胞微環境有著顯著差異（圖3）。對于整張切片的高度異質性活檢，Xenium能夠提供高質量的數據，表明它有能力應對富有挑戰性的組織類型。
Xenium原位分析的另一個強大優勢在于它能夠在Xenium運行后對同一組織切片進行免疫熒光染色（圖4）。這種功能之所以能夠實現，是因為儀器上非破壞性的生化和解碼循環保留了蛋白質表位。盡管一些空間技術能夠提供RNA和蛋白表達的分析，但其中許多需要使用連續的載玻片來分析不同的分析物類型，這使得分析物無法同時實現大規模可視化。在Xenium處理過程中，組織的完整性得以保留，這意味著在Xenium處理后也可以進行H&E染色（圖2C）。獲得同一張組織切片的組織病理學、蛋白表達和基因表達數據，可幫助您更全面地了解樣本的生物學特征。
在探究腫瘤是否會繼續保持良性還是轉變成侵襲性這樣的復雜生物學問題時，大海撈針有時似乎比破譯癌癥背后的分子機制要簡單一些。然而，每一個新的生物學機制都有可能改變我們診斷和治療癌癥的方式，甚至在某一天還能治愈癌癥。
參考資料：
- Chang AY & Marshall WF. Organelles – understanding noise and heterogeneity in cell biology at an intermediate scale. J Cell Sci 130: 819–826 (2017). doi: 10.1242/jcs.181024
- Goldman SL, et al. The impact of heterogeneity on single-cell sequencing. Front Genet 10: 8 (2019). doi: 10.3389/fgene.2019.00008
- Moses L & Pachter L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods 19: 534–546 (2022). doi: 10.1038/s41592-022-01409-2
- Janesick A, et al. High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue. bioRxiv (2022). doi: 10.1101/2022.10.06.510405
- Pal B, et al. A single-cell RNA expression atlas of normal, preneoplastic and tumorigenic states in the human breast. The EMBO Journal. 40: e107333 (2021). doi: 10.15252/embj.2020107333
- The American Cancer Society. (2021, November 8). Breast cancer hormone receptor status. Understanding a breast cancer diagnosis. Retrieved April 13, 2023, from https://www.cancer.org/cancer/breast-cancer/understanding-a-breast-cancer-diagnosis/breast-cancer-hormone-receptor-status.html
- Dunnwald LK, Rossing MA & Li CI. Hormone receptor status, tumor characteristics, and prognosis: a prospective cohort of breast cancer patients. Breast Cancer Res 9: R6 (2007). doi: 10.1186/bcr1639
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