oxBS-seq測序揭示復發性膀胱癌甲基化和羥甲基化水平及相關轉錄變化
近日，徐州市中心醫院（徐州醫科大學徐州臨床學院）史振鐸等為第一作者、韓從輝教授為通訊作者在《Biomarker Research》雜志發表題為“Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression”的研究論文，該研究通過全外顯子組測序、簡化基因組甲基化測序（RRBS）+氧化簡化基因組甲基化測序（oxRRBS）及對應的轉錄組測序（RNA-seq）等多組學方法揭示了復發性膀胱癌的甲基化和羥甲基化水平及相關轉錄變化，并鑒定出用于預測PD-L1表達的生物標志物。深圳市易基因科技為本研究提供oxRRBS+RRBS和RNA-seq測序服務。
標題：Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression
時間：2023-01-13
期刊：Biomarker Research
影響因子：IF 8.633
技術平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、全外顯子組測序等
研究摘要：
背景：膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，但其高復發率和對免疫治療的響應機制仍不清楚，導致臨床結果預測困難。表觀遺傳學變化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌進展中起著重要作用，且越來越多地作為診斷或預后預測的生物標志物進行研究。然而，由于此前傳統的亞硫酸鹽測序方法（RRBS）不能區分5mC和5hmC信號，導致關于羥甲基化知之甚少。
方法：本研究使用多組學方法來繪制了原發性和復發性膀胱癌的基因組、轉錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組圖譜。
結果：本研究通過全外顯子組測序鑒定出參與UBC進展的的基因突變（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而這些基因突變中與UBC復發或PD-L1下調幾乎不相關。整合RRBS和oxRRBS-seq數據，鑒定出在復發性膀胱癌中顯著富集5hmC相關轉錄變化的脂肪酸氧化相關基因。在PD-L1高表達的膀胱癌樣本中發現NFATC1（一種高度參與T細胞免疫應答的基因）基因體中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因組中的5mC和5hmC變化呈負相關，因此僅基于RRBS數據結合了5mC和5hmC信號，減弱了癌癥相關信號標記，不適合用作臨床生物標志物。
結論：通過UBC樣本的多組學分析，結果表明表觀遺傳變化比基因突變更多參與UBC復發和PD-L1調節，證明了使用DNA甲基化標記物預測膀胱癌患者免疫治療反應的潛力。研究還表明僅僅采用RRBS方法聯合檢測5mC和5hmC水平會降低表觀遺傳生物標志物的預測準確性，揭示了使用oxRRBS-seq進行甲基化標記發現的優勢。
項目設計：
（1）樣本選取：
選取行腹腔鏡膀胱根治術（LRC）、膀胱部分切除術（PC）或經尿道膀胱腫瘤切除術（TURBT）的膀胱癌患者組織樣本，采集膀胱腫瘤組織和癌旁組織。手術后立即用無菌生理鹽水清潔組織，并儲存在-80°C以進行檢測。共采集45例患者膀胱組織標本45份，其中膀胱癌組織45份，癌旁組織18份。
（2）項目設計流程圖：
結果圖形
圖1：單堿基分辨率對膀胱癌樣品進行5mC和5hmC分析。
（A） 在膀胱癌樣品中鑒定出的顯著5mC和5hmC DMR數量。
（B） 5mC和5hmC DMR的基因組注釋。
膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。
膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。
（B） RNA-seq用5hmC DMR標準化脂肪酸代謝相關基因數量。
（C） 對TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特異性qPCR驗證。
（D和E）復發性膀胱癌中的差異甲基化譜與組織收集后發生復發性UBC的5名患者之間的相關性。
（B） PD-L1高表達膀胱癌癥樣本中5mC DMR生物標記物的甲基化變化熱圖。
（C） PD-L1高表達膀胱癌中差異性5hmC水平和差異性5mC水平之間的相關性散點圖。
圖4：利用5mC生物標志物預測免疫治療反應。
（A） TET基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化水平變化。
（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化預測PD-L1高表達的膀胱癌AUC評分。
（C） 注釋到NFATC1的5mC DMR軌跡圖（左），預測PD-L1高表達膀胱癌的一種NFATC1-DMR預測AUC評分（右）。
總結：
本研究采用改進的全基因組DNA甲基化和DNA羥甲基化圖譜繪制方法，將氧化還原代表性亞硫酸鹽測序（oxRRBS）與傳統RRBS相結合。oxRRBS可以實現5hmC至fC的選擇性氧化。羥甲基化水平可以通過從RRBS中減去從oxRRBS獲得的亞硫酸鹽測序信號來確定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分別計算精確的5mC和5hmC水平，從而以更高的分辨率提供更詳細的表觀遺傳學信息，更適合用作膀胱癌診斷和預后的生物標志物。
關于精準DNA甲基化/羥甲基化測序（oxBS-seq）
羥甲基化5hmC是哺乳動物基因組上的第六堿基，在發育、衰老、神經退行性疾病、復雜疾病及腫瘤發生過程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發現的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點。隨著研究的深入，發現之前被認為是檢測DNA甲基化標準的重亞硫酸鹽測序并不能區分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。
易基因聯合劍橋大學建立了化學氧化法結合重亞硫酸鹽轉化的測序技術（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結合同時單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。
傳統BS轉化無法區分5mC和5hmC
傳統的Bisulfite測序中，5hmC經過Bisulfite處理后變為CMS，CMS在測序中仍然被讀作C堿基，因此不能區分5mC和5hmC。
oxBS技術原理
技術優勢：
技術指標：
參考文獻：
Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.
標題：Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression
時間：2023-01-13
期刊：Biomarker Research
影響因子：IF 8.633
技術平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、全外顯子組測序等
背景：膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，但其高復發率和對免疫治療的響應機制仍不清楚，導致臨床結果預測困難。表觀遺傳學變化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌進展中起著重要作用，且越來越多地作為診斷或預后預測的生物標志物進行研究。然而，由于此前傳統的亞硫酸鹽測序方法（RRBS）不能區分5mC和5hmC信號，導致關于羥甲基化知之甚少。
方法：本研究使用多組學方法來繪制了原發性和復發性膀胱癌的基因組、轉錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組圖譜。
結果：本研究通過全外顯子組測序鑒定出參與UBC進展的的基因突變（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而這些基因突變中與UBC復發或PD-L1下調幾乎不相關。整合RRBS和oxRRBS-seq數據，鑒定出在復發性膀胱癌中顯著富集5hmC相關轉錄變化的脂肪酸氧化相關基因。在PD-L1高表達的膀胱癌樣本中發現NFATC1（一種高度參與T細胞免疫應答的基因）基因體中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因組中的5mC和5hmC變化呈負相關，因此僅基于RRBS數據結合了5mC和5hmC信號，減弱了癌癥相關信號標記，不適合用作臨床生物標志物。
結論：通過UBC樣本的多組學分析，結果表明表觀遺傳變化比基因突變更多參與UBC復發和PD-L1調節，證明了使用DNA甲基化標記物預測膀胱癌患者免疫治療反應的潛力。研究還表明僅僅采用RRBS方法聯合檢測5mC和5hmC水平會降低表觀遺傳生物標志物的預測準確性，揭示了使用oxRRBS-seq進行甲基化標記發現的優勢。
項目設計：
（1）樣本選取：
選取行腹腔鏡膀胱根治術（LRC）、膀胱部分切除術（PC）或經尿道膀胱腫瘤切除術（TURBT）的膀胱癌患者組織樣本，采集膀胱腫瘤組織和癌旁組織。手術后立即用無菌生理鹽水清潔組織，并儲存在-80°C以進行檢測。共采集45例患者膀胱組織標本45份，其中膀胱癌組織45份，癌旁組織18份。
（2）項目設計流程圖：
結果圖形
圖1：單堿基分辨率對膀胱癌樣品進行5mC和5hmC分析。
（B） 5mC和5hmC DMR的基因組注釋。
膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。
膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。
圖2：復發性膀胱癌的5mC和5hmC分析。
（A） 在復發性膀胱癌樣品中鑒定出的5mC和5hmC DMR的數量（左），5mC和5hmC DMR的基因組注釋（右）。（B） RNA-seq用5hmC DMR標準化脂肪酸代謝相關基因數量。
（C） 對TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特異性qPCR驗證。
（D和E）復發性膀胱癌中的差異甲基化譜與組織收集后發生復發性UBC的5名患者之間的相關性。
圖3：PD-L1高表達膀胱癌癥的甲基化變化。
（A） PD-L1高表達膀胱癌癥樣本中鑒定的5mC和5hmC DMR數量（左），5mC和5hmC DMRs的基因組注釋（右）。（B） PD-L1高表達膀胱癌癥樣本中5mC DMR生物標記物的甲基化變化熱圖。
（C） PD-L1高表達膀胱癌中差異性5hmC水平和差異性5mC水平之間的相關性散點圖。
圖4：利用5mC生物標志物預測免疫治療反應。
（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化預測PD-L1高表達的膀胱癌AUC評分。
（C） 注釋到NFATC1的5mC DMR軌跡圖（左），預測PD-L1高表達膀胱癌的一種NFATC1-DMR預測AUC評分（右）。
總結：
本研究采用改進的全基因組DNA甲基化和DNA羥甲基化圖譜繪制方法，將氧化還原代表性亞硫酸鹽測序（oxRRBS）與傳統RRBS相結合。oxRRBS可以實現5hmC至fC的選擇性氧化。羥甲基化水平可以通過從RRBS中減去從oxRRBS獲得的亞硫酸鹽測序信號來確定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分別計算精確的5mC和5hmC水平，從而以更高的分辨率提供更詳細的表觀遺傳學信息，更適合用作膀胱癌診斷和預后的生物標志物。
關于精準DNA甲基化/羥甲基化測序（oxBS-seq）
羥甲基化5hmC是哺乳動物基因組上的第六堿基，在發育、衰老、神經退行性疾病、復雜疾病及腫瘤發生過程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發現的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點。隨著研究的深入，發現之前被認為是檢測DNA甲基化標準的重亞硫酸鹽測序并不能區分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。
易基因聯合劍橋大學建立了化學氧化法結合重亞硫酸鹽轉化的測序技術（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結合同時單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。
傳統BS轉化無法區分5mC和5hmC
傳統的Bisulfite測序中，5hmC經過Bisulfite處理后變為CMS，CMS在測序中仍然被讀作C堿基，因此不能區分5mC和5hmC。
oxBS技術原理
技術優勢：
- DNA甲基化檢測全新的“標準”；
- 單堿基檢測DNA羥甲基化修飾；
- 多重質控標準檢測氧化效率和Bisulfite轉換率；
- 實驗偏好性低，重復性高（R2＞0.98）；
- 易基因自主研發的甲基化特異性多重PCR引物設計軟件；
- 可滿足多種測序應用需求：
- 全基因組氧化甲基化測序（oxWGBS）
- 簡化基因組氧化甲基化測序（oxRRBS）
- 目標區域靶基因氧化甲基化測序（Target-oxBS）。
技術指標：
參考文獻：
Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com