scRNA-seq在彌漫性大B細胞淋巴瘤的單細胞轉錄組圖譜繪制中的應用
期刊：Cell Reports
導語
彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是最常見但侵襲性最強的B細胞淋巴瘤之一，大約40%的患者仍然無法治愈。本研究使用單細胞測序（scRNA-seq）技術成功繪制了彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）的單細胞轉錄組圖譜，揭示了DLBCL病例內部、病例之間的表型異質性。還首次揭示了DLBCL腫瘤細胞與微環境細胞的互作網絡，并進一步驗證了HBV感染對腫瘤細胞生存及免疫逃逸方面的影響，深入地解析了DLBCL的生物學特點，也為DLBCL免疫治療方面提供了新的啟示。
研究技術
scRNA-seq
研究路線
對17例DLBCL（HBV+×7，EBV+×2，HBV-EBV-×8），1例濾泡性淋巴瘤FL（HBV-EBV-），Burkitt’s淋巴瘤BL（HBV+），1例淋巴組織增生RLH（HBV+）共20個樣本進行scRNA-seq，對DLBCL惡性細胞和良性細胞繪制綜合細胞圖譜，再對腫瘤微環境中惡性B細胞、T細胞、骨髓細胞進行深入分析。
研究結果
1.DLBCL單細胞圖譜揭示惡性B細胞的腫瘤間異質性
對來源于17個DLBCL 和3個對照樣本的 94,324個細胞進行單細胞RNA測序（圖1A），利用標記基因區分出B細胞（54%）、T細胞（41%）、髓系細胞（2.8%）、NK細胞（0.8%）、成纖維細胞（0.4%）、內皮細胞（0.4%），并采用拷貝數變異（copy number variation, CNV）成功將惡性B細胞（46.5%）與正常B細胞（7.5%）區分開來（圖1B、1C）。隨后在每種主要細胞類型（>所有細胞的1%）內進行重新聚集，總共鑒定出23個惡性細胞亞群和29個非惡性細胞亞群（圖1D）。在惡性B和T細胞亞群中發現了更多的細胞，并且每個細胞表達的基因數量與惡性B細胞亞群相關（圖1E）。此外，惡性B細胞具有高度的患者特異性，而不同個體的非惡性細胞具有相似的基因表達譜（圖1F）。針對來源于每一個患者的惡性B細胞進一步分析，每個DLBCL樣本的惡性細胞中發現了一組獨特的高表達基因，采用非負矩陣分解（NMF），共鑒定出73不同的基因表達特征，最終定義了8個常見表達特征，這也提示了DLBCL在不同患者之間以及腫瘤內部存在高度異質性（圖1G）。
圖1 B細胞淋巴瘤單細胞圖譜
2. HBV+患者腫瘤細胞中MHC-II表達特征基因的高表達
為估計在惡性B細胞中發現的任何共享表特征是否與HBV感染相關，對 HBV+和 HBV- EBV-組的樣本之間的表達評分進行了比較，只有 MHC II 表達特征的表達評分在 HBV+ 組中顯著較高（圖2A）。此外，屬于MHC II表達特征的9個基因在每一個HBV+患者的惡性細胞中顯著高于HBV-EBV-組。隨后對HBV+和HBV- EBV-惡性細胞之間的基因表達譜進行了直接比較，MHC II表達特征的基因確實是HBV+惡性B細胞中差異表達的基因之一（圖2B）。緊接著比較了DL05和DL13兩個樣本診斷和復發的惡性細胞，在復發樣本DL13中，從惡性細胞中提取了7個基因表達特征，其中6個特征與DL05中鑒定的特征重疊（圖2C）。值得注意的是，MAPK特征只在DL13中表達。隨后對DL05和DL13的惡性B細胞進擬時序分析，總共確定了2個分支點和5個狀態（圖2I），通過關注疾病復發的機制，在軌跡的分支點 2 處進行分支分析，鑒定出一組在狀態5下高表達的基因，包括幾個MAPK信號相關基因，這可能與DLBCL患者的復發有關（圖2K）。
圖2 DLBCL的腫瘤內和腫瘤外異質性
3. 非惡性B細胞亞群細分
針對非惡性B細胞進行重新聚類，細分得到5個Naive B亞群和3個Memory B細胞亞群（圖3A-3C）。隨后鑒定了每個亞簇中差異和高表達的基因，并將其聚類為7個基因集（圖3D-3E）。HBV+ 組中富集的Bmemory-1似乎與HBx刺激有關，并可能與病毒復制有（圖3G）。同樣有趣的是，在 HBV+ 樣本中發現了表達EGR2和表達EGR3的惡性B細胞，這表明來自HBV+患者的DLBCL樣本中的惡性細胞亞群也可能與HBx刺激相關（圖3H）。EBV+ DLBCL樣本中的B細胞 Bmemory-3 亞群可能與EBV感染有關。對浸潤性非惡性B細胞進行軌跡分析，確定了2個主要軌跡，并在軌跡的分支點1處進一步進行分支分析，鑒定出富含多種途徑的基因，推測它們可能決定HBV相關的細胞命運（圖3I-3L）。
圖3 B細胞淋巴瘤中的非惡性B細胞
4. T細胞亞群細分
對T細胞進行重新聚類，得到CD4+T細胞、CD8+T細胞共16個亞群，根據之前的研究最終劃分為5個分類，分別為初始T細胞、細胞毒性T細胞、調節性T細胞 （Treg）、T （Tfh） 、 T 17 （Th17）（圖4A-4C）。對于細胞毒性 CD8+ T細胞，細胞毒性標記物的表達水平與共抑制受體的表達水平高度相關，表明這些 T 細胞中可能存在激活依賴性耗竭表達程序（圖4D）。通過比較平均細胞毒性和耗竭分數，發現兩個細胞毒性亞簇 CD8cyto-4 和 CD8cyto-6 比其他細胞毒性亞簇具有更強的耗竭狀態（圖4E）。所有T細胞亞簇均由來自三個或更多樣本的細胞組成（圖4F）。隨后鑒定了每個亞群的差異和高表達基因，并將其聚類為 14 個基因集（圖4G）。在 HBV+ 和HBV-EBV- 組之間未觀察到每個樣本的T細胞亞群百分比存在顯著差異（圖4H）。對CD8+T細胞和CD4+T細胞分別進行軌跡分析，都確定了2條主要軌跡，其中CD8+T細胞兩條主要軌跡細胞毒性和耗竭分數都很高（圖4I-4J）。
圖4 B細胞淋巴瘤中的T細胞
5. 骨髓細胞亞群細分
針對髓細胞進行重新聚類，得到3個巨噬細胞亞群（MP）、2個傳統DC亞群（cDC）、一個漿細胞樣DC（pDC）亞群共6個脊髓細胞亞群（圖5A-5C）。其中cDC-c1亞群高表達CLEC9A，pDC亞群高表達CLEC4C，cDC-c2亞群高表達LAMP3的同時還高表達CD274，表明 DC 亞群對T細胞具有潛在的抑制作用（圖5E-5J）。HBV+和HBV-EBV-組之間DC亞群的比例沒有觀察到顯著差異，有趣的是，cDC-c2亞群主要與DLBCL的ABC亞型相關（圖5C）。結合巨噬細胞的體外功能表型M1和M2分析，結果顯示MP-c1與促炎M1特征密切相關，MP-c2與抗炎M2特征和吞噬作用特征相關，MP-c3與M2和血管生成特征的高表達相關（圖5F）。另外，對HBV+患者的DLBCL樣本中觀察到MP-c2 的百分比顯著較高（圖5G），還對 MP-c2 中的巨噬細胞與其他亞群中的巨噬細胞之間的基因表達進行了比較，確定了MP-c2 中優先表達的 11 個基因（圖5H）。
圖5 B細胞淋巴瘤中的髓系細胞
6. 腫瘤微環境中亞群間的調控關系
為了解細胞亞群之間的調控關系，研究免疫相關的配體-受體對相互作用，結果顯示骨髓細胞亞群擁有最多數量的配體，而細胞毒性 CD8+ T 細胞亞群擁有最多數量的受體（圖6A，最能預測抗原呈遞細胞和T細胞之間的調節軸（圖6B）。重點關注與惡性細胞的相互作用，例如，CD40LG-CD40可能促進HBV+ 組DLBCL中惡性細胞與初始CD4+T細胞之間更強的相互作用（圖6C-6E）。此外，CD4+ Tfh和惡性細胞之間通過BAFF介導的信號傳導存在暗示性相互作用，并且這些相互作用僅在 HBV+ 患者中觀察到（圖6D）。DLBCL的另一個值得注意的發現是預測惡性細胞和 CD8+毒性細胞以及Tregs之間的CD70-CD27 相互作用，這可能進一步導致T細胞耗竭和抑制（圖6F-圖G）。
圖6 基于配體-受體互作的細胞通訊
參考文獻：
Ye X, Wang L, Nie M, Wang Y, Dong S, Ren W, Li G, Li ZM, Wu K, Pan-Hammarström Q. A single-cell atlas of diffuse large B cell lymphoma. Cell Rep. 2022 Apr 19;39（3）:110713. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110713. PMID: 35443163.
