人精子ChIP-seq和DNA甲基化WGBS揭示與生育和發育相關重疊區域
目前，六分之一的夫婦患有不孕不育，其中多達一半的病例由男性因素引起，在過去的40年中，精子數量下降了50%。盡管導致精子質量和數量下降的因素知之甚少，但環境-表觀基因組相互作用是可能的。暴露于有毒物質、飲食和 BMI 升高與精子表觀基因組變化和男性臨床人群的生育能力降低有關。然而，這些研究的重點主要集中在DNA甲基化水平上，而對染色質與精子中DNA甲基化之間相關性知之甚少。父系不良環境暴露與不孕不育和不良結果相關，這種作用可能通過精子的組蛋白修飾傳遞。到目前為止，對男性精子染色質的深入分析還很有限。
2021年7月20日，加拿大麥吉爾大學Vanessa Dumeaux和Sarah Kimmins團隊在《Cell Reports》雜志發表題為“Whole-genome sequencing of H3K4me3 and DNA methylation in human sperm reveals regions of overlap linked to fertility and development”的研究論文，該研究以男性精子樣本為對象，通過ChIP-seq和WGBS等技術研究了 H3K4me3 在精子中的位點及其與相同樣本中精子 DNA 甲基化譜的關系。
標題：Whole-genome sequencing of H3K4me3 and DNA methylation in human sperm reveals regions of overlap linked to fertility and development（人類精子中H3K4me3和DNA甲基化的全基因組測序揭示了與生育和發育相關的重疊區域）
時間：2021-7-20
期刊：Cell Reports
影響因子：8.8
技術平臺：ChIP-seq、WGBS等
研究摘要：
本研究使用深度測序來表征37名男性代表性參考群體中精子的組蛋白H3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)和DNA甲基化圖譜。分析結果表明，H3K4me3靶向全基因組和生育和發育相關基因。在原始生殖細胞、胚胎增強子和短穿插核元件(short-interspersed nuclear elements，SINEs)中逃避表觀遺傳重編程區域也表現出富集。H3K4me3和DNA甲基化在全基因組中存在顯著重疊，表明這些標記之間存在潛在的相互作用，而此前報道的這些標記在精子中互斥。精子中H3K4me3標記區域與胚胎轉錄組的比較分析表明，父本染色質對胚胎基因表達有影響。
研究要點
研究摘要
研究結果：
圖1：H3K4me3在人類精子的CpG區域、啟動子區和SINE區富集
從30名男性的精子中制備樣本上進行H3K4me3的ChIP-seq，使用MACS2來命名peaks。
（2）SINE、低復雜性重復序列或胚胎增強子的攜帶H3K4me3啟動子與不同的胚胎過程有關
圖2：精子H3K4me3 peaks與CpG富集區、重復元件和hESC增強子之間的重疊
（A-F）基因組瀏覽器快照顯示參考基因組的ChIP-seq軌跡（藍色）、MACS2 calling的H3K4me3 peaks值（深藍色框）、CpG島位點軌跡（紅色框，UCSC）、GC百分比熱圖（藍色，低GC百分比；白色，50%GC；紅色，高GC百分比）、SINE位點（深灰色框）、低復雜性重復序列（深紫色框），LINE位點（紫色框）（從RepeatMasker獲得）和hESC增強子的位置（淺藍色框）。H3K4me3與這些元件中的每一個重疊是RNA介導的基因沉默AGO4（A）的Argonaute基因家族成員，編碼微管蛋白亞型TUBA4A和TUBA4B（B）的兩個基因，輔助雙鏈斷裂修復RAD51（C）的基因，發育基因ID4（D）和SOX11（E），以及最后對于隨機基因間區域（F）進行了說明。
（3）H3K4me3 和 DNA 甲基化同時發生在人類精子的功能基因組區域
圖3：人類精子中H3K4me3 peaks值區域的DNA甲基化水平
對用于H3K4me3 ChIP-seq的30名男性精子進行WGBS，并評估位于H3K4me3 peak內CpGs的DNA甲基化水平。然后計算peaks標記區域的平均DNA甲基化水平。
A. 具有低DNA甲基化(低甲基化，甲基化≤20%)、中等DNA甲基化(20%≤甲基化≤80%)或高DNA甲基化(高甲基化，甲基化≥80%)的H3K4me3 peaks數。
B. H3K4me3信號(單位:RPKM)中低甲基化(23023個peaks)、中等甲基化(8,087個peaks)或高甲基化(16,777個peaks)H3K4me3 peaks中心（±5kb）的DNA甲基化水平熱圖(單位:%)。每條線代表一個H3K4me3 peaks。所有peaks的H3K4me3信號和DNA甲基化在熱圖的頂部總結。
© H3K4me3 peaks內基因組、CpG、RNA和重復序列注釋的低甲基化、中等甲基化和高甲基化DNA比例。
圖4：人類精子中H3K4me3和DNA甲基化譜
H3K4me3 peaks和DNA甲基化之間的重疊顯示在基因組瀏覽器快照中，顯示了HOXA發育基因簇（A）的ChIP-seq軌跡(藍色)、MACS2 calling的H3K4me3 peaks(深藍色)、WGBS軌跡(黑色)、CpG島位點軌跡(紅色，UCSC)和GC百分比熱圖(藍色，低GC %;白色，50% GC;紅色，高GC %)，染色質修飾蛋白ARID5B (B)，精原細胞標記物ZBTB16/PLZF (C)和精子發生基因CYLC2 (C)。H3K4me3 peaks位于非DNA甲基化的CpG島(黃色)，包括不同甲基化水平區域(紫色)，CpG DNA低甲基化區域(綠色)和中等DNA甲基化區域(灰色)。
（4）精子H3K4me3與DNA甲基化在精子發生和胚胎發生過程中基因調控的功能關系探討
圖5：DNA甲基化水平在精子發生、胚胎發生和基本細胞過程的功能基因啟動子區H3K4me3 peaks變化
圖6：H3K4me3精子peaks區域的H3K4me3/H3K27me3二價性，存在低、中或高DNA甲基化
H3K4me3和H3K27me3信號(單位：RPKM)在H3K4me3 peaks中心(±5kb)在人類精子(參考30名男性的H3K4me3和已發表的H3K27me3數據(hamoud etal .， 2009))、8細胞人類胚胎和內細胞團(Xia etal .，2019)、 hESC (Grandy etal .， 2015)和人類胎兒器官(Yan etal .，2016) 熱圖。每個通道代表在參考人群中鑒定的具有DNA低甲基化(23,023)、中甲基化(8,087)、高甲基化(16,777)或未知甲基化(沒有CpG或在WGBS中覆蓋小于10倍的CpG)的H3K4me3 peaks區域，或者未被H3K4me3標記的H3K27me3精子peaks區域。
（5）精子中的H3K4me3靶向增強子和逃避表觀遺傳重編程區域
圖7：H3K4me3在hESC增強子和逃避重編程區域富集
（A） H3K4me3富集在已鑒定的hESC增強子和超級增強子處達到峰值（Barakat等人，2018），在亞穩態表等位基因區域（Kessler et al.，2018）以及在人類原始生殖細胞（PGCs）中通過DNA甲基化缺失而逃避重編程區域達到峰值（Tang等人，2015）。正富集Bioconductor包regioneR確定的Z評分表示。對于顯示的所有區域，通過排列檢驗，p＜0.001。
（B） 與感興趣區域相交或不相交的低甲基化、中等甲基化和高甲基化H3K4me3 peaks比例。不相交于感興趣區域的peaks和相交的peaks比例變化通過χ2檢驗進行檢驗，星號表示p<0.001。
本研究的局限性
本研究遵循ENCODE指南，使用DNA甲基化分析的金標準——WGBS，和H3K4me3的深度ChIP-seq分析了加拿大男性代表群體的精子表觀基因組。ChIP-seq在7名男性個體中進行驗證，WGBS通過定制精子MCC-seq方法進行驗證。這種方法的局限性是MCC-seq不能覆蓋全基因組。但本研究捕獲中覆蓋區域驗證了WGBS的區域。當然有可能忽略到某些區域的H3K4me3和DNA甲基化存在很強的個體變異性。在未來的研究中，盡管組蛋白保留水平低，但一旦染色質的單細胞分析足夠敏感，可以分析精子，就可以解決精子與精子之間的異質性。
參考文獻：
Lu Y, Zhou J, Li F, Cao H, Zhang X, Yu D, He Z, Ji H, Lv K, Wu G, Yu M. The Integration of Genome-Wide DNA Methylation and Transcriptomics Identifies the Potential Genes That Regulate the Development of Skeletal Muscles in Ducks. Int J Mol Sci. 2023 Oct 23;24(20) pii: ijms242015476.
2021年7月20日，加拿大麥吉爾大學Vanessa Dumeaux和Sarah Kimmins團隊在《Cell Reports》雜志發表題為“Whole-genome sequencing of H3K4me3 and DNA methylation in human sperm reveals regions of overlap linked to fertility and development”的研究論文，該研究以男性精子樣本為對象，通過ChIP-seq和WGBS等技術研究了 H3K4me3 在精子中的位點及其與相同樣本中精子 DNA 甲基化譜的關系。
標題：Whole-genome sequencing of H3K4me3 and DNA methylation in human sperm reveals regions of overlap linked to fertility and development（人類精子中H3K4me3和DNA甲基化的全基因組測序揭示了與生育和發育相關的重疊區域）
時間：2021-7-20
期刊：Cell Reports
影響因子：8.8
技術平臺：ChIP-seq、WGBS等
研究摘要：
本研究使用深度測序來表征37名男性代表性參考群體中精子的組蛋白H3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)和DNA甲基化圖譜。分析結果表明，H3K4me3靶向全基因組和生育和發育相關基因。在原始生殖細胞、胚胎增強子和短穿插核元件(short-interspersed nuclear elements，SINEs)中逃避表觀遺傳重編程區域也表現出富集。H3K4me3和DNA甲基化在全基因組中存在顯著重疊，表明這些標記之間存在潛在的相互作用，而此前報道的這些標記在精子中互斥。精子中H3K4me3標記區域與胚胎轉錄組的比較分析表明，父本染色質對胚胎基因表達有影響。
研究要點
- 深度測序鑒定人類精子中攜帶H3K4me3的區域
- H3K4me3廣泛分布于基因組中，在啟動子和SINE處富集
- 精子H3K4me3標記發育基因并與胚胎基因表達相關
- 除了DNA低甲基化位點外，H3K4me3還與高甲基化區域重疊
研究摘要
研究結果：
- 組蛋白H3K4me3在精子基因和調控區域富集
圖1：H3K4me3在人類精子的CpG區域、啟動子區和SINE區富集從30名男性的精子中制備樣本上進行H3K4me3的ChIP-seq，使用MACS2來命名peaks。
- 基于基因組和CpG注釋以及重復元件和低復雜性DNA序列重疊的H3K4me3 peaks位點。從Bioconductor軟件包annotatr (Cavalcante and Sartor, 2017)和RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org/)中獲得注釋。不同注釋之間peaks重疊通過連接節點來表示，重疊peaks數量顯示在它們上方條形圖上，顯示前10個重疊。
- 每個特定注釋的H3K4me3 peaks富集。通過使用Bioconductor封裝區域器(Gel et al.， 2016)確定Z分數來表示陽性和陰性富集。對于所有顯示的注釋，通過排列測試，p < 0.001。
- 每次重復注釋的H3K4me3 peaks富集；排列檢驗P < 0.001。
（2）SINE、低復雜性重復序列或胚胎增強子的攜帶H3K4me3啟動子與不同的胚胎過程有關
圖2：精子H3K4me3 peaks與CpG富集區、重復元件和hESC增強子之間的重疊
（A-F）基因組瀏覽器快照顯示參考基因組的ChIP-seq軌跡（藍色）、MACS2 calling的H3K4me3 peaks值（深藍色框）、CpG島位點軌跡（紅色框，UCSC）、GC百分比熱圖（藍色，低GC百分比；白色，50%GC；紅色，高GC百分比）、SINE位點（深灰色框）、低復雜性重復序列（深紫色框），LINE位點（紫色框）（從RepeatMasker獲得）和hESC增強子的位置（淺藍色框）。H3K4me3與這些元件中的每一個重疊是RNA介導的基因沉默AGO4（A）的Argonaute基因家族成員，編碼微管蛋白亞型TUBA4A和TUBA4B（B）的兩個基因，輔助雙鏈斷裂修復RAD51（C）的基因，發育基因ID4（D）和SOX11（E），以及最后對于隨機基因間區域（F）進行了說明。
（3）H3K4me3 和 DNA 甲基化同時發生在人類精子的功能基因組區域
圖3：人類精子中H3K4me3 peaks值區域的DNA甲基化水平
對用于H3K4me3 ChIP-seq的30名男性精子進行WGBS，并評估位于H3K4me3 peak內CpGs的DNA甲基化水平。然后計算peaks標記區域的平均DNA甲基化水平。
A. 具有低DNA甲基化(低甲基化，甲基化≤20%)、中等DNA甲基化(20%≤甲基化≤80%)或高DNA甲基化(高甲基化，甲基化≥80%)的H3K4me3 peaks數。
B. H3K4me3信號(單位:RPKM)中低甲基化(23023個peaks)、中等甲基化(8,087個peaks)或高甲基化(16,777個peaks)H3K4me3 peaks中心（±5kb）的DNA甲基化水平熱圖(單位:%)。每條線代表一個H3K4me3 peaks。所有peaks的H3K4me3信號和DNA甲基化在熱圖的頂部總結。
© H3K4me3 peaks內基因組、CpG、RNA和重復序列注釋的低甲基化、中等甲基化和高甲基化DNA比例。
圖4：人類精子中H3K4me3和DNA甲基化譜
H3K4me3 peaks和DNA甲基化之間的重疊顯示在基因組瀏覽器快照中，顯示了HOXA發育基因簇（A）的ChIP-seq軌跡(藍色)、MACS2 calling的H3K4me3 peaks(深藍色)、WGBS軌跡(黑色)、CpG島位點軌跡(紅色，UCSC)和GC百分比熱圖(藍色，低GC %;白色，50% GC;紅色，高GC %)，染色質修飾蛋白ARID5B (B)，精原細胞標記物ZBTB16/PLZF (C)和精子發生基因CYLC2 (C)。H3K4me3 peaks位于非DNA甲基化的CpG島(黃色)，包括不同甲基化水平區域(紫色)，CpG DNA低甲基化區域(綠色)和中等DNA甲基化區域(灰色)。
（4）精子H3K4me3與DNA甲基化在精子發生和胚胎發生過程中基因調控的功能關系探討
圖5：DNA甲基化水平在精子發生、胚胎發生和基本細胞過程的功能基因啟動子區H3K4me3 peaks變化
- H3K4me3過表達在精子發生相關基因啟動子區域具有低、中、高平均DNA甲基化peaks值。與早期精子發生、減數分裂和精子發生相關的基因選自兩個數據庫：Db1（Jan et al.，2017）和Db2（Wang et al.，2018）。給出了Benjamini-Hochberg校正的超幾何最小似然p值。
- 基因啟動子（TSS上游1kb）中的H3K4me3 peaks的GO分析。通過PANTHER過表征測試（GO生物過程完成）檢測特定生物過程中的富集度。P值通過Fisher精確檢驗確定，并對多次檢驗進行Bonferroni校正。過濾富集度≥1.25的非冗余過程后，顯示p值最低的前10個過程。
圖6：H3K4me3精子peaks區域的H3K4me3/H3K27me3二價性，存在低、中或高DNA甲基化H3K4me3和H3K27me3信號(單位：RPKM)在H3K4me3 peaks中心(±5kb)在人類精子(參考30名男性的H3K4me3和已發表的H3K27me3數據(hamoud etal .， 2009))、8細胞人類胚胎和內細胞團(Xia etal .，2019)、 hESC (Grandy etal .， 2015)和人類胎兒器官(Yan etal .，2016) 熱圖。每個通道代表在參考人群中鑒定的具有DNA低甲基化(23,023)、中甲基化(8,087)、高甲基化(16,777)或未知甲基化(沒有CpG或在WGBS中覆蓋小于10倍的CpG)的H3K4me3 peaks區域，或者未被H3K4me3標記的H3K27me3精子peaks區域。
（5）精子中的H3K4me3靶向增強子和逃避表觀遺傳重編程區域
圖7：H3K4me3在hESC增強子和逃避重編程區域富集
（A） H3K4me3富集在已鑒定的hESC增強子和超級增強子處達到峰值（Barakat等人，2018），在亞穩態表等位基因區域（Kessler et al.，2018）以及在人類原始生殖細胞（PGCs）中通過DNA甲基化缺失而逃避重編程區域達到峰值（Tang等人，2015）。正富集Bioconductor包regioneR確定的Z評分表示。對于顯示的所有區域，通過排列檢驗，p＜0.001。
（B） 與感興趣區域相交或不相交的低甲基化、中等甲基化和高甲基化H3K4me3 peaks比例。不相交于感興趣區域的peaks和相交的peaks比例變化通過χ2檢驗進行檢驗，星號表示p<0.001。
本研究的局限性
本研究遵循ENCODE指南，使用DNA甲基化分析的金標準——WGBS，和H3K4me3的深度ChIP-seq分析了加拿大男性代表群體的精子表觀基因組。ChIP-seq在7名男性個體中進行驗證，WGBS通過定制精子MCC-seq方法進行驗證。這種方法的局限性是MCC-seq不能覆蓋全基因組。但本研究捕獲中覆蓋區域驗證了WGBS的區域。當然有可能忽略到某些區域的H3K4me3和DNA甲基化存在很強的個體變異性。在未來的研究中，盡管組蛋白保留水平低，但一旦染色質的單細胞分析足夠敏感，可以分析精子，就可以解決精子與精子之間的異質性。
參考文獻：
Lu Y, Zhou J, Li F, Cao H, Zhang X, Yu D, He Z, Ji H, Lv K, Wu G, Yu M. The Integration of Genome-Wide DNA Methylation and Transcriptomics Identifies the Potential Genes That Regulate the Development of Skeletal Muscles in Ducks. Int J Mol Sci. 2023 Oct 23;24(20) pii: ijms242015476.
標簽：
WGBS
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