圖1.NbNdhM抵抗TuMV侵染機制示意圖

首先，作者通過對TuMV侵染后的本氏煙草進行轉錄組測序分析，發現NbNdhM基因的表達水平受病毒侵染的影響。并通過實驗驗證其過表達可以抑制TuMV的復制，而沉默會促進病毒侵染。其次，進一步證明了NbNdhM通過誘導核周葉綠體的聚集抵御TuMV侵染，并且與TuMV VPg進行相互作用。此外，研究還顯示不同植物物種的NdhM與不同病毒的蛋白均存在相互作用，表明NdhM可能是病毒侵染植物的共同靶標。最后，作者發現TuMV VPg通過與NdhM的相互作用，改變NdhM的定位并增加核積累，干擾核周葉綠體的聚集，從而抑制葉綠體的防御作用。       

本文要點          

要點一：NbNdhM基因沉默/過表達實驗       

TuMV侵染初期會增加NbNdhM的表達水平，但隨著侵染時間的延長，表達水平下調。研究人員利用植物活體成像系統（Lumazone sophia）可視化熒光蛋白標記的蕪菁花葉病毒（TuMV-GFP）侵染程度。如圖2b，c所示，在3天后，觀察到感染植物葉片上出現TuMV-GFP的熒光。在4天后，NbNdhM沉默植株（TRV：NbNdhM）葉片上的熒光高于對照組（TRV：00），說明沉默NbNdhM后會促進TuMV侵染。圖3a-c則證明了過表達NbNdhM可以抑制TuMV的侵染。    

圖2.沉默NbNdhM促進TuMV侵染

圖3.過表達NbNdhM抑制TuMV侵染

要點二：NbNdhM誘導核周葉綠體聚集抵御TuMV侵染    

過表達NbNdhM可以促進葉綠體圍繞細胞核聚集，防御TuMV侵染。而沉默NbNdhM則會導致抑制這種聚集現象。

圖4.NbNdhM誘導核周葉綠體聚集

要點三：TuMV蛋白VPg與NbNdhM的相互作用

作者通過酵母雙雜交（Y2H）、熒光素酶互補成像（LCI）、免疫共沉淀（Co-IP）以及熒光互補實驗（BiFC）等多種方法證明了TuMV蛋白VPg與NbNdhM的相互作用。             

圖6.TuMV VPg與NbNdhM相互作用

(a)Y2H實驗，表明蕪菁花葉病毒（TuMV）VPg與NbNdhM存在相互作用。將pGBKT7-53 + pGADT7-T共轉化到酵母Y2HGold中作為陽性對照；pGBKT7 + pGADT7-NbNdhM，pGBKT7-TuMV VPg + pGADT7-T以及pGBKT7-Lam + pGADT7-T作為陰性對照。共轉化的酵母在含有X-α-gal和AbA的選擇培養基SD-Ade-His-Leu-Trp中，30℃下培養4-6天。

(b)LCI實驗，表明TuMV VPg與NbNdhM存在相互作用。在熒光素存在的情況下，共表達cLUC-NbNdhM和TuMV VPg-nLUC產生了生物發光信號；β-葡萄糖苷酸酶（GUS）為非相互作用蛋白，作為陰性對照。使用Lumazone Sophia 2048B植物活體成像系統檢測。

(c)Co-IP實驗，表明TuMV VPg與NbNdhM存在相互作用。NbNdhM-GFP和TuMV VPg-cMyc在本氏煙草葉片中共表達。以空GFP、TuMV VPg-cMyc、NbNdhM-GFP和GUSp-cMyc的共表達作為陰性對照。

(d)BiFC實驗，表明TuMV VPg與NbNdhM存在相互作用。NbNdhM的C端與YFP的N端片段融合，TuMV VPg與YFP的C端片段融合。 

原文信息：Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection
作者：Jianping Chen，Fei Yan et al.
單位：Institute of Plant Virology，China
期刊：Plant, Cell & Environment
原文鏈接：https://doi.org/10.1111/pce.14157

技術應用 

熒光素酶互補成像實驗（LCI技術）：將熒光素酶蛋白分為N端和C端2個功能片段, 即NLuc和CLuc。待測的2個目的蛋白分別與N-Luc和C-Luc融合。當2個目標蛋白相互作用時，NLuc和C-Luc緊密結合，恢復熒光素酶的催化活性，促使熒光素酶底物氧化而發光。通過植物活體成像系統檢測生物發光的強度，從而對蛋白之間的相互作用進行定性和定量分析。此方法已被廣泛應用于動植物相關領域的蛋白質互作研究。

植物活體成像系統(Lumazone)應用：高通量突變體篩選、逆境處理研究、生物節律、激素信號、蛋白互作等實驗，以及甲基化和鈣信號傳導等極弱信號生物發光/熒光成像實驗。