你一定聽說過Cre-lox重組系統，無論你是否直接進行過基因操作。由于Cre-lox系統具有操作簡單、重組率高的優點，如今已經成為體內外遺傳操作的強有力工具。利用Cre-lox系統，可以在特定細胞、組織或整個生物體，甚至在特定時間點敲除或表達某個基因，實現對特定基因的時空特異性操作，這對基因功能的研究和人類疾病動物模型的建立都具有深刻影響。

傳統的Cre-lox系統雖然可以特異性的標記目的細胞的靶基因。同時后續也可以通過CreERT2的方式，實現時間上對Cre的控制。但是在使用過程中還是常常遇到各種問題：單基因是否能特異性的標記某類細胞？他莫昔芬誘導要不要考慮代謝問題，毒性問題呢？萬一這類細胞找不到合適的靶基因又該怎么呢？今天小編為您細說Cre-lox系統的老套路和新玩法。
 

老套路
環化重組酶（Cre, cyclization recombinase），是酪氨酸位點特異性重組酶之一，能催化兩個DNA識別位點之間的位點特異性重組。Cre重組酶來源于P1噬菌體，由 343個氨基酸組成，能特異性地識別Lox位點。

Cre重組酶識別的回文DNA位點，也叫loxP (locus of X-over P1) 位點，長34bp，其特征結構為ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT，兩邊反向互補的13個堿基為Cre重組酶的識別序列。
 

合理利用Cre-Lox系統可以實現對基因的操控，根據您的需求進行基因的條件性表達或和條件性敲除。關于Cre-lox系統的原理與基本應用，我們官網上有詳細介紹哦，點擊此處鏈接可閱讀，感興趣的點擊下方了解吧。

新玩法
基于小鼠的Cre-lox系統應用
早在2003年 Jean-Paul Herman團隊就提出Cre酶由于缺乏對其活動的有效時間控制，它的實用性仍然受到限制，后來他們開發了 DiCre，一種用于 Cre 的可調節片段互補系統。Cre酶被分成兩個部分，分別與 FKBP12（FK506 結合蛋白12）和 FRB（FKBP12-雷帕霉素相關蛋白的結合域）融合，再通過雷帕霉素的誘導快速重組，利用雷帕霉素與FKBP12和FRB結構域結合后，可以直接誘導這兩個結合結構域的異二聚化的原理，實現Cre酶的時間調控（Nicolas Jullien et al., Nucleic Acids Res. 2003）。
 

Principles of the DiCre system. (A) Scheme of the DiCre system. The enzyme is split into two fragments without enzymatic activity, that are fused to proteins (here FKBP12 and FRB) that can be dimerized by a small molecule ligand. Dimerization leads to the association of the complementing Cre moieties and the reconstitution of enzymatic activity. (C) Schematic representation of the constructs used for DiCre. The translation initiation codon has been placed into the context of Kozak’s consensus sequence. NLS corresponds to a nuclear localization signal peptide. The unique NheI (N) and BamHI (B) sites flanking the linker sequence allow its simple replacement with variants.

2009年Frank Kirchhoff團隊針對Cre/loxP系統單基因的表達模式存在不特異性的問題，且單啟動子不足以從遺傳學上定義不同的神經細胞類型，他們在上述研究基礎上改進了DiCre，并重新定義為“split-Cre”系統。具有 N 端或 C 端 Cre 片段的分別融合到酵母轉錄激活因子 GCN4 的組成型二聚化卷曲螺旋亮氨酸拉鏈域中（兩個拉鏈區可以由α螺旋一側的Leu之間的疏水作用形成拉鏈，并以α螺旋超卷曲的連接方式形成二聚體），分別定義為NCre 和 CCre，通過GCN4的二聚化實現Cre的重組。在此結構的基礎上連接上不同基因的啟動子，實現在發育過程中 NCre 和 CCre 的短暫但同時表達的細胞才具有Cre活性（Johannes Hirrlinger et al., PLoS One. 2009）。
 

A: Principle of split-Cre complementation. NCre- and CCre-coding sequences are placed under the control of two different promoters (promoter 1 and 2, respectively). Only if both promoters are active, functional complementation takes place and LoxP (red triangles) – flanked sequences are recombined, thereby activating reporter genes (A1) or excising exons for knock-out strategies (A2). Ubi: ubiquitously expressed promoter (in our study the ROSA26 promoter). B: Design of fusion proteins. NCre- and CCre-proteins were constructed by fusing amino acids 19–59 (NCre) or amino acids 60–343 (CCre) of the sequence of Cre recombinase to the constitutive active coiled-coil interaction domain of the yeast transcription factor GCN4 (GCN4cc). Immunotags (Flag, Myc), a linker sequence as well as a nuclear localization sequence (NLS) were also added.

兩個研發團隊通過不同的方式都實現了對Cre活性的調控，“split-Cre”系統可以說是在DiCre基礎上做了完善，實現了Cre作用的更精準更特異，但是卻舍棄了DiCre實現對Cre時間上的調控的設計初衷，隨著技術的發展CreERT2進入了人們的視野，但是化學誘導不可避免存在一定的毒性，這個問題對一些藥物敏感性實驗成為了致命打擊。

2020年Haifeng Ye團隊針對化學誘導毒性問題，并結合前人研究，提出了新的系統遠紅光誘導分裂Cre-loxP系統-FISC系統。該系統將Cre的N端融合到Coh2結構域，Cre的C端與DocS結構域融合，并由遠紅外光（FRL）響應啟動子pFRLx驅動，在FRL光照下，基于Coh2和DocS結構域的強親和力，當將兩個片段結合在一起時，Cre酶才能擁有重組酶活性，行使相應功能（Jiali Wu et al., Nat Commun. 2020）。
 

Design and optimization of the far-red light-induced split Cre-loxP system (FISC system). Schematic representation of the FISC system. Cre recombinase was split into two fragments: CreN59 (residues 1–59) fused to Coh2 driven by a constitutive promoter (PhCMV) and CreC60 (residues 60–343) fused to DocS driven by the far-red light (FRL, 730 nm)-inducible promoter (PFRLx). Upon FRL illumination, the photoreceptor BphS is activated toconvert intracellular guanylate triphosphate (GTP) into cyclic diguanylate monophosphate (c-di-GMP). The cytosolic c-di-GMP production induces bindingof the far-red light-dependent transactivator FRTA (p65-VP64-BldD) to its synthetic promoter PFRLx to drive DocS-CreC60 expression. Consequently, the catalytic activities of Cre recombinase can be restored once the two Cre fragments assemble based on affifinity interactions of their respective Coh2 and DocS fusion domains, enabling to excise DNA sequences flflanked by loxP sites

以上研究都是基于小鼠為研究模型對Cre-loxP系統的不同應用，南模生物可提供超過300多種自主產權Cre工具鼠，覆蓋全身各類型的細胞組織，滿足科研人員多樣化的需求。同時，南模生物長期提供Cre工具鼠定制服務，可按具體實驗要求進行定制，滿足不同實驗室需求。
 

基于AAV的Cre-lox系統應用
固然，根據具體實驗方案定制培育Cre小鼠是更貼合實驗需求的方式，但定制Cre小鼠不僅費時而且昂貴，且管理多種Cre小鼠品系更是繁瑣易錯，那么這一問題又該怎么解決呢？

重組腺相關病毒載體(AAV)介導的Cre-loxP系統很好的解決了上述問題，將目的元件包括啟動子和增強子，以及內含子、微小 RNA 識別序列和內部核糖體進入位點（IRES或2A），重組酶（Cre、CreER、Flp 或 FlpER），翻譯后調控元件，如 WPRE 或 3'-UTR等，構建出特異性組織或者細胞表達的Cre工具鼠（Leila Haery et al., Front Neuroanat. 2019）。
 

Several aspects of experimental design affect neuronal targeting and manipulation including (A) viral delivery method, (B) composition of viral capsid proteins, (C) promoters and/or enhancers driving transgene expression, (D) IRES or 2A elements for multicistronic expression coupled with fluorescent proteins (FP) or protein epitopes, (E) post-translational regulatory elements such as WPRE or 3′-UTR, and (F) Recombinase (Cre, CreER, Flp, or FlpER) expression from transgenic driver lines (inserted genomically via targeted or random integration) and ligand-dependent or recombinase-dependent expression elements such as TRE or lox sites, respectively. Abbreviations: TRE, tetracycline-response element; lox, LoxP sequence; IRES, internal ribosomal entry site; 2A, 2A sequence for self-cleavage; FP, fluorescent protein; WPRE, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element; 3′-UTR, 3′-untranslated sequence.

但是AAV轉導的效率和特異性也會受到很多因素的影響，比如說：給藥的途徑、AAV血清型、AAV滴度和給藥劑量等，同時哺乳動物的基因轉錄的調控元件通常分布在數千到數十萬個堿基上，但是AAV 基因組的包裝能力是有限的（小于5kb），所以識別與 AAV 兼容的啟動子一直具有挑戰性。這些也都使AAV介導Cre-loxP系統受到了一定的限制，所以到底是用老鼠或是AAV還是要視情況而定的。

南模生物利用AAV介導的Cre-flox系統構建了豐富的動物模型，部分驗證數據如下：

小鼠肺癌模型

由氣管霧化注射AAV-Cre病毒至KL小鼠(NM-CKO-234719)肺部，使Cre在小鼠肺部特異性表達，誘導Stk11表達缺失與Kras-G12D突變，可誘發肺癌發生。

小鼠PKD運動障礙模型

腺相關病毒介導 Cre 在小腦內局部敲除 Prrt2 表達，導致熱誘導性運動障礙的發作。

南模生物Find Cre^®數據庫
南模生物深耕基因修飾動物模型行業二十余年，為快速精準地選擇合適Cre工具鼠，特推出Find Cre®數據庫。該數據庫包含超過300多種自主產權Cre重組酶工具鼠，以小鼠組織、器官和系統為主線，可分為肺、肝、胃腸道、乳腺、胰腺、感覺器官、心血管系統、免疫系統、神經系統、泌尿生殖系統、骨骼肌系統以及其他組織器官。大家只要選擇自己感興趣的組織器官，就可以查看該組織下可用的Cre工具鼠。
 

參考文獻：
Nicolas Jullien et al. Regulation of Cre recombinase by ligand-induced complementation of inactive fragments. Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):e131. doi: 10.1093/nar/gng131.

Johannes Hirrlinger et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 2009;4(1):e4286. doi: 10.1371/journal.pone.0004286. Epub 2009 Jan 27.

Jiali Wu et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 2020 Jul 24;11(1):3708.doi: 10.1038/s41467-020-17530-9.

Leila Haery et al. Adeno-Associated Virus Technologies and Methods for Targeted Neuronal Manipulation. Front Neuroanat. 2019 Nov 26:13:93.doi: 10.3389/fnana.2019.00093. eCollection 2019.

Tan GH, Liu YY, Wang L, et al. PRRT2 deficiency induces paroxysmal kinesigenic dyskinesia by regulating synaptic transmission in cerebellum. Cell Res. 2018;28(1):90-110. doi:10.1038/cr.2017.128