導讀
   
弧菌是一種普遍存在的革蘭氏陰性菌屬，廣泛存在于溫帶水生和海洋環境中，隨著水溫升高，給人類健康帶來新的問題，弧菌由100多種弧菌屬組成，其中12種可致人類感染，其中霍亂弧菌最為常見，可引起嚴重腹瀉病，其他兩種常見的非霍亂弧菌是副溶血性弧菌和創傷弧菌，與弧菌病有關，例如傷口感染、敗血癥和胃腸炎，主要通過接觸受污染的水和食用受污染的海產品（主要是牡蠣）傳人。弧菌的表征與檢測正在從基于培養的傳統方法轉向新方法的應用，如定量PCR，數字PCR，NGS等。瑞士科學家發表于BMC Genomics的文章“Vibrio-Sequins - dPCR-traceable DNA standards for quantitative genomics of Vibrio spp”建立Vibrio-Sequins的DNA標準使用數字PCR（dPCR）進行絕對定量，再通過DNA標準品對弧菌屬進行NGS測序定量分析，降低文庫制備和測序的技術偏差。
 
應用亮點：

▶  開發六種DNA標準品，命名為Vibrio-Sequins ，同時配套優化的 TaqMan檢測方法，用于dPCR方法進行DNA文庫絕對定量拷貝數濃度（cp/μL）的檢測。定量限LOQ 范圍：20-120 cp/μL，檢測限LOD均為 ~ 10 cp/μL。
 
▶  數字PCR作為更精準的方法，用于驗證NGS定量方法的準確性。
 
▶ 通過DNA標準品將NGS和dPCR兩種技術串聯應用，提高基于NGS測序定量分析的精密度和準確度。
  
研究成果：
   
（A）三種用于定量弧菌DNA基質中Vibrio-Sequins的雙鏈dPCR 方法（HC1-LC1、rplA-xni、ushA-valS）拷貝數濃度對數的線性擬合分析。
 
（B）用于定量弧菌DNA 基質中Vibrio-Sequins的三種 dPCR 方法（HC1-LC1、rplA-xni、ushA-valS）的未轉化的線性關系。斜率表示標準品的Qubit和dPCR 測量值之間的差異。
 
（A-B）測量相應標準品的PCR擴增子的拷貝數范圍為3–50000 cp/μL。數據表示擴展測量不確定度（±MU）的平均值 （n = 10; nruns= 3）。
 
（C）Vibrio-Sequins標準品的dPCR方法驗證的相關結果。顯示的數據是三次dPCR實驗總體平均拷貝數濃度（cp/μL）和總體CV值（%），重復性（%），批間重復性（%），標準不確定度（%），以及k=2的MU不確定度。
   （A） 散點圖顯示單DNA文庫中Vibrio-Sequins標準品的預期拷貝數濃度 （cp/μL）與測量拷貝數濃度 （cp/μL） 的線性關系。預期拷貝數濃度是指在對樣品進行加標后為每個標準品計算的拷貝數濃度，基于Vibrio-Sequins的dPCR定量結果。測得拷貝數濃度是指樣品經過文庫制備后dPCR測得的拷貝數濃度。圖中顯示了Vibrio-Sequins混合物（1 = 圓形和 2 = 正方形）的六種標準品 HC1（紫黑色）、LC1（深藍色）、rplA（青藍色）、ushA（綠色）、valS（淺綠色）和 xni（黃色）中每個標準品的單個重復的拷貝數 （cp/μL）（1 = 圓形），以及變異系數（黑色）±變異系數 （%CV; n = 10）。
（B） DNA 文庫中Vibrio-Sequins測序定量的準確性。散點圖顯示了Vibrio-Sequins中（1 = 圓形和 2 = 正方形）六種標準品 HC1 （藍色）、LC1 （紫色）、rplA （粉紅色）、ushA （紅色）、valS （橙色） 和 xni（黃色）中每個標準品單個重復的非歸一化覆蓋率 （1 = 圓形和 2 = 正方形） 與Vibrio-Sequins的投入濃度 （attomoles/μL）。
（C） DNA 文庫 （S28-S47） 內Vibrio-Sequins測序定量的準確性。散點圖顯示了兩種Vibrio-Sequins（1 = 圓形和 2 = 正方形）中六種標準品 HC1（淡紫色）、LC1（紫色）、rplA （粉紅色）、ushA（紅色）、valS（橙色）和 xni（黃色）中每個標準品單個重復的歸一化覆蓋率 （1 = 圓形和 2 = 正方形） 與Vibrio-Sequins的投入濃度 （attomoles/μL）。通過對DNA文庫中Vibrio-Sequins的最低覆蓋率進行子采樣讀取，進行歸一化。
（D） 三種不同的弧菌DNA混合物（A、B 和 C）由 Qubit 定量，包括來自霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創傷弧菌和梅茨尼科維弧菌的不同量的DNA，并以 2%的豐度加入Vibrio-Sequins混合物 1（混入 A 和 B）或Vibrio-Sequins混合物 2（混入C）。
（E） 采用 [23] 中開發的方法，使用DNA文庫（S28、S29和S38 = 弧菌混合物A-C）中Vibrio-Sequins的dPCR拷貝數濃度（cp/μL），針對三種弧菌DNA混合物（A、B 和 C）中的對弧菌來源的DNA進行定量。
 
微生物DNA的基因組分析和定量越來越多地應用于弧菌屬的基礎研究和診斷。與傳統的基于培養的方法相比，基于測序的方法的顯著優勢是不需要任何關于樣品的前期信息。此外，可以檢測到非常少量的弧菌衍生DNA以及不可培養的弧菌菌株。然而，盡管（宏）基因組學具有不可或缺的技術優勢，但由于文庫制備、測序和比對過程中出現的技術偏差，很難對結果數據進行定量分析和樣本間比較。
 
Vibrio-Sequins可用于確定和減少誤差源和DNA文庫間的差異，也可用于在不同的文庫制備和測序方法之間、實驗和批間以及單個 DNA 文庫之間進行歸一化，保留生物學上有意義的差異的同時，顯著減少技術變量來源的偏差。除了質量標準化外，Vibrio-Sequins還是弧菌屬 DNA定量的重要工具。
 
作者已經證明，通過將NGS與可量值溯源標準品的 dPCR 方法串聯，并通過使用Vibrio-Sequins標準品，實現了混合樣本中幾種弧菌 DNA 的精確定量。因此，該方法可能應用于定量宏基因組樣品中未知數量的DNA，從而能夠檢測痕量的弧菌DNA。Vibrio-Sequins的實施以及NGS與dPCR的聯合應用，將提高現有宏基因組測序方法的準確性。
 
結論：
通過參考標準品將NGS和dPCR聯合應用，提高基于NGS的定量方法的精密度和準確度，為測序定量的計量可追溯性提供了途徑，為將測量科學整合到基于NGS的方法中開辟了新思路。
原文鏈接如下：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10318669/
 
 
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