小鼠實驗中PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR技術的介紹與應用
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看到這里的小伙伴都會有疑問了
什么是“P人呢”？
P就是在我們日常實驗，尤其是小鼠實驗中的各種PCR包括：PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR等。下面我就一一為大家講解。
PCR
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1976年，中國科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。主要反應步驟可以總結為：高溫變性，低溫退火，中溫延伸。
① 高溫變性：通過高溫（約95℃）加熱一定時間，將模板DNA解離成單鏈的形式，以便與引物結合；② 低溫退火（復性）：降溫至約55℃時，引物與模板DNA單鏈按照堿基互補配對原則結合；③ 中溫延伸：再將溫度調至約72℃（適合DNA聚合酶反應的溫度），在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板和引物結合物沿著磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向，按照堿基配對和半保留復制原則合成一條新的、與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。通過經歷變性、退火和延伸幾個循環后，待擴增的基因可以被擴增放大幾百萬倍（1）。
這類PCR在小鼠中主要用于基因敲除和敲入小鼠等轉基因生物的基因型鑒定（2）。
當然在開始PCR前DNA的抽提將決定整個實驗的成敗，DNA的抽提方法及后續建議使用濃度可以參考我們之前的推文：
https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2382/post_type/1.html
在反應過程中有的時候會發現出現了非預期條帶，那么可能是您的反應體系存在污染，這部分內容之前我們也有詳細的介紹如何避免污染哦：https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2384/post_type/1.html
qPCR
實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。
1 TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。
2 SYBRGreenⅠ熒光染料法：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖
PCR產物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產物的單一性）
數據分析
通過實時熒光收集到的信號，儀器會自動繪制熒光曲線，通常5-15個循環的熒光信號都屬于背景信號，然后將其設置為擴增曲線的背景或基線。在理想條件下，PCR產物量呈指數倍增長Yn=Y0×2^n（X0：初始模板量，n：PCR循環次數，Yn：第n次循環后的產物量）。但實際上可能引物模板引物消耗完，DNA聚合酶逐漸失活等原因，產物量就恒定。熒光強度就呈“S型”曲線即“擴增曲線（Amplication plot）”，分為基線期、指數增長期和平臺期。再根據待測樣品的Ct，可計算樣品拷貝數/濃度。通常模板每稀釋10倍，CT值增大3.33。如果研究基因表達量通過比較達到設定熒光閾值所需的Ct值大小，可以比較出基因表達量的高低。
qPCR主要應用：
2、基因拷貝數的檢測：能夠準確的定量出相關基因在染色體中的拷貝數。
3、特殊RNA的轉錄水平檢測：根據特殊RNA的結構，如microRNA、circRNA等，設計其特殊引物，如莖環結構引物、反向引物等，對這類RNA的轉錄水平進行定性、定量分析。
RT—PCR
RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。整個反應過程分為兩步，第一步是經反轉錄酶的作用，從RNA合成cDNA的過程；第二步是以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下擴增目的片段的過程。
作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發夾結構的真核細胞mRNA，3種都可（3）。
RT-PCR其操作方法分為兩種，即一步法和兩步法。一步法RT-PCR，逆轉錄同PCR擴增結合在一起，即cDNA合成與PCR擴增反應在同一管Buffer及酶中進行，一步完成。兩步法RT-PCR，RNA首先在反轉錄酶的作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，分成兩步進行。
RT—PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平、細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-qPCR
定量逆轉錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是應用于以RNA作為起始材料的PCR實驗中的一種實驗方法。在該方法中，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過逆轉錄酶轉錄成互補DNA（cDNA）。隨后，以cDNA為模板進行qPCR反應。
RT-qPCR可通過一步法或兩步法來完成。一步法RT-qPCR把逆轉錄與PCR擴增結合在一起，使逆轉錄酶與DNA聚合酶在同一管內同樣緩沖液條件下完成反應。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中，逆轉錄和PCR擴增過程是在兩個管中完成，使用不同的優化的緩沖液、反應條件、以及引物設計策略。
RT-qPCR已被用于多種分子生物學的應用中，其中包括基因表達分析、RNA干擾驗證、微陣列驗證、病原體檢測、基因測試和疾病研究（4）。
希望這篇“P文”能對您的實驗有一定幫助，讓您成為一個合格的“P人”。最后，大家如果不想在PCR鑒定上浪費時間，南模生物也可提供大小鼠基因型鑒定服務，更多詳情請聯系我們。
1.多重聚合酶鏈式反應技術研究和應用．中國知網
2.Nobel Media AB (2014) The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information. nobelprize.org
3.胡奇林，林鋒強，陳少鶯等. 應用RT-PCR技術檢測番鴨呼腸孤病毒．《中國獸醫學報》，2004
4.Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.
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