Fig 1. 成人甲基化圖譜

2. 甲基化的個體間變異
甲基化模式在不同的個體中非常穩健。對于大多數細胞類型，0.5%或更少的細胞塊在不同的供體中顯示出50%或以上的差異，而在不同細胞類型的樣本中顯示出的差異為4.9%，說明了DNA甲基化主要由細胞譜系和細胞類型特異性程序決定，而不是由遺傳或環境因素決定。

3. 甲基化記錄了發育歷史
雖然DNA甲基化模式反映了細胞的功能特性，但它們也可以用來追蹤細胞的發育歷史。為了識別早期祖細胞的后代共享的模式，作者計算了至少4個cpg塊內的平均甲基化，并選擇了在所有樣本中顯示變異性最高的塊。然后使用一種無監督的凝聚算法對所有205個甲基化組進行了聚類，該分析系統地將相同細胞類型的生物樣本進行了分組。這支持了細胞分離的可重復性，并表明每種正常細胞類型的三到四次重復足以推斷其甲基化模式，用于實際應用，如生物標志物識別。該算法沒有對相關的細胞類型進行分組，而且通常根據供體身份對樣本進行聚類。這進一步強調了仔細純化均質細胞類型的重要性，避免了混合細胞群。
 

Fig 2. 無監督的聚集聚類反映了人類健康細胞類型的發育譜系

4. 細胞類型特異性的甲基化標記物
將205個樣本組織成39組特定的細胞類型，包括血細胞類型、乳腺上皮、肺上皮、胰腺內分泌和外分泌細胞、不同來源的血管內皮細胞、心肌細胞和心肌成纖維細胞等。重點關注由5個或更多cpg組成的差異甲基化塊，這些cpg在一組細胞類型中未被甲基化，但在所有其他樣本中均被甲基化，反之亦然。幾乎所有區域（97%）在一種細胞類型中都未被甲基化，而在其他所有其他細胞類型中都被甲基化。然后根據靶細胞類型與所有其他樣本的甲基化的絕對差異對這些差異區域進行了分類。

每種細胞類型的前25個差異未甲基化區域包含了一個由1246個標記組成的人類細胞類型特異性甲基化圖譜。這些區域在特定的細胞類型中是獨特的未甲基化的（平均甲基化13%），在所有其他樣本中是甲基化的（平均甲基化91%），并且可以作為敏感的生物標志物，用于定量來自混合物中特定細胞類型的DNA的存在。這些標記物包括953個細胞類型特異性的未甲基化的位點，以及另外293個未甲基化的位點在少數相關的細胞類型中。
 

Fig 3. 39種細胞類型的205個樣本的人類甲基化圖譜

5. 人類細胞類型特異性調控圖譜
作者分析了通過測序（ATAC-seq）、DNase I超敏位點測序（DNaseI-seq）和組蛋白修飾特異性標記的DNA可及性和染色質狀態。單核細胞和巨噬細胞的前250個未甲基化標記物高度可及，在單核細胞中有H3K27ac和H3K4me1，而其他細胞類型的標記物在單核細胞中沒有富集，其他細胞類型的標記物也有類似的結果。還發現了chromHMM增強子注釋在細胞類型特異性標記上富集。這些發現與之前的研究一致，即組織特異性去甲基化與基因增強子有關。

為了進一步評估細胞類型特異性未甲基化區域的生物學重要性，作者研究了它們與轉錄因子（TFs）的關聯，這些轉錄因子可能影響DNA甲基化，也可能以細胞類型特異性的方式結合DNA，這取決于甲基化和染色質。作者鑒定了每個細胞類型的前1000個未甲基化標記物，并使用HOMER39進行了基序分析，從而計算已知TF結合基序的富集情況。對于大多數細胞類型，頂部基序包括主調節因子和關鍵TFs。這種細胞類型特異性的未甲基化區域和TF結合基序之間的關聯可以識別新的基因調控回路，并暴露在特定細胞類型中活躍的遠端增強子。這突出了許多細胞類型的標志性基因，并提出了每種細胞類型的前25個未甲基化標記的假定靶點。這些發現進一步支持了這樣一個原則，即特定細胞類型中未甲基化的位點可能是增強子，正向調節該細胞類型中表達的基因，通常控制鄰近基因。然而，在特定的細胞類型中，與特定未甲基化的位點相鄰的基因通常廣泛表達于這種細胞類型之外。

為了生成每種細胞類型中假定的調節區域的目錄，對每種細胞類型的所有樣本進行了片段水平分析，獨立于其他細胞類型。掃描了整個基因組，并確定了至少85%具有至少4個cpg的DNA片段未甲基化的基因組區域。這在分析的39個細胞類型組中確定了一組未甲基化的基因組區域，其中平均包括36111個區域。然后對這些區域進行了基因組特征注釋，結果顯示，平均56%的CpG島重疊，46%位于啟動子區域附近，44%的CTCF結合位點重疊，從而突出了未甲基化位點的調控和結構作用。
 

Fig 4. 細胞類型特異性標記作為假定的增強因子

6. 細胞類型特異性的高甲基化位點
作者研究了那些在一種細胞類型中甲基化但在人體其他地方未甲基化的基因組區域。這些區域富集于CpG島（38%的甲基化區域，而細胞類型特異性的未甲基化區域為1.7-2.7%），并在其他細胞類型中被H3K27me3和Polycomb標記。這些細胞類型特異性的高甲基化區域通常對基序富集不那么顯著，只有大約3%的細胞類型特異性差異甲基化區域被高甲基化。

在匯集了所有細胞類型特異性的高甲基化區域后，發現了染色質調節因子CTCF的目標序列的強富集。這表明CTCF結合位點的DNA甲基化可能作為一個組織特異性的調控開關來調節其結合，并可能影響組織特異性。為了驗證這一想法，作者比較了CTCF位點的DNA甲基化模式與特定組織中全基因組CTCF蛋白結合模式。特定細胞類型中甲基化的位點被富集為神經基因轉錄抑制因子re1沉默TF/神經元限制性沉默因子（REST/ NRSF）的靶點（P≤1×10-24），這在胰島細胞的甲基化組中最為顯著。雖然DNA甲基化尚未被證明會影響REST的結合或活性，但這一發現提出了一種可能性，即胰島中REST靶點的甲基化可以允許獨立于REST抑制的內分泌分化。
 

Fig 5. CpG島、Polycomb靶點、CTCF和REST/NSRF的細胞類型特異性高甲基化區域豐富

7. 片段級的甲基化組反褶積
作者開發了一種用于DNA甲基化測序數據的計算片段級反褶積算法，并使用每種細胞類型定義的前25個標記（共1246個標記）來研究從復合組織樣本和cfDNA中獲得的甲基組。

對于每一種細胞類型，作者采用留一的方法在白細胞讀取中混合一個保留的樣本，然后使用反褶積算法來推斷混合物中的細胞組成。在濃度從0到10%不同的情況下重復了這個過程。如圖6a所示，發現1246個標記（每個細胞類型的前25個）可以在大約0.1%的分辨率下準確檢測來自給定來源的DNA，與基于陣列的方法相比，提高了近一個數量級。

利用來自23名健康捐贈者的WGBS數據估計了白細胞和cfDNA的細胞組成；99.5%的白細胞來源的DNA屬于粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和NK、T和B細胞，與典型的血細胞計數一致。健康受試者的cfDNA主要來源于白細胞：粒細胞（29.7%）、單核/巨噬細胞（20%）和淋巴細胞（3%）。有助于cfDNA的實體組織包括血管內皮細胞（6%）和肝細胞（3.1%），與之前的結
果一致。
 

Fig 6. 使用細胞類型特異性生物標志物的片段級反褶積

參考文獻：
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