腫瘤轉移是指癌細胞從原發部位通過不同途徑轉移到身體其它組織器官，并形成新的病灶的過程。腫瘤轉移是大多數癌癥相關死亡的主要原因。在卵巢癌病例中，循環癌細胞首先從血流、淋巴血管或腹膜液中的流體環境中滲出，到達遠端器官。由于高機械應力等原因，轉移性外滲是一個低效的過程，只有一小部分癌細胞成功侵入目標組織實質。然而，作為細胞最基本的、組成成分的脂質在支持癌細胞外滲的特性仍然知之甚少。

2024年11月，西湖大學鄒貽龍、王曦團隊合作，在國際頂尖學術期刊 Cell 上發表了題為：ACSL4 and polyunsaturated lipids support metastatic extravasation and colonization 的研究論文。該研究揭示了多種癌癥的轉移潛能和鐵死亡易感性之間的相關性，轉移的癌細胞具有更高的鐵死亡敏感性和多不飽和脂肪酸脂質（PUFA-Lipid）含量。長鏈酯酰輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, ACSLs)屬于多基因家族編碼的酶，是機體內脂肪代謝的關鍵酶，主要催化12~20個碳鏈長度的脂肪酸,三磷酸腺苷和輔酶A形成長鏈酰基輔酶A。ACSL4是ACSL家族中的一員,參與對花生四烯酸和二十碳五烯酸的調控。本研究發現ACSL4通過增強膜流動性和細胞侵襲性促進轉移性外滲，還通過促進多不飽和脂肪酸（PUFA）向酰基輔酶A（acyl-CoA）的酯化發揮促進鐵死亡的作用。該研究還發現，多不飽和脂肪酸脂質在促轉移的同時，依賴ECH1等限速酶，共抑制ACSL4和ECH1，可有效抑制腫瘤轉移。這項研究不僅揭示了癌癥轉移的新機制，還為開發靶向腫瘤轉移的新型藥物奠定了基礎。

技術路線圖

1. 腫瘤轉移潛能與鐵死亡敏感性之間的相關性

利用 MetMap 數據庫和 CTRP 數據庫來評估癌細胞系的轉移潛能及其對鐵死亡誘導劑的敏感性之間的關系，結果發現具有高轉移潛能的卵巢癌、肝癌和頭頸癌細胞系對鐵死亡誘導劑更敏感。進一步利用臨床樣本分離原代癌細胞，通過體外實驗發現來自腹水或網膜的腫瘤細胞比原發腫瘤細胞對鐵死亡更敏感。隨后采用液相色譜-串聯質譜 (LC-MS/MS) 技術分析了卵巢癌細胞中的脂質成分，發現轉移性腫瘤細胞中多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著增加，表明脂質代謝在腫瘤轉移中發揮重要作用。

圖1. 腫瘤轉移潛能與鐵死亡敏感性之間的相關性

2. 卵巢癌轉移模型構建

從MetMap數據庫中篩選出了具有高轉移潛能和高鐵死亡敏感性的卵巢癌細胞系ES-2來構建模型，進一步通過重復體內篩選，從肝臟和肺組織中分離出具有高轉移能力的ES-2細胞克隆，命名為ES-2-MC1-Hep和ES-2-MC1-Lung。鐵死亡誘導劑處理之后發現，兩種細胞對誘導劑的敏感性更高。脂質組學的研究進一步發現，ES-2-MC1-Lung細胞中PUFA含量升高，尤其是含有C20:4和C22:6側鏈的磷脂酰乙醇胺(PEs)。

3. 構建體內基因篩選模型

通過兩輪體內篩選，從小鼠肝臟中篩選出具有高轉移效率的ES-2-MC2-Hep細胞。利用靶向288個磷酸酶的CRISPR sgRNA文庫進行了遺傳篩選，成功地識別了多個候選的肺臟轉移抑制基因(PTPRG和PTPN3)和促進基因(PPA1和PPP2R1A)。

圖2. 構建卵巢癌高效轉移模型

4. NMNAT1和ACSL4是調控卵巢癌轉移的關鍵基因

通過體內CRISPR篩選，發現NMNAT1、HADHB、PTPRG和ATP6V1H與肝臟和肺轉移相關。其中NMNAT1介導NAD生物合成并參與各種原發癌癥的進展，敲除NMNAT1可以抑制卵巢癌肝臟和肺轉移。隨后又利用CRISPR-Cas9技術敲除和回補實驗發現，ACSL4參與脂肪酸代謝，敲除 ACSL4 可以抑制卵巢癌肺轉移。

圖3. NMNAT1和ACSL4是調控卵巢癌轉移的關鍵基因

5. ACSL4促進癌細胞外滲

免疫熒光分析顯示，靜脈內植入ES-2-MC2-HEP-sgACSL4細胞形成的轉移灶更少、更小。為了進一步闡明ACSL4的外滲作用，使用ACSL4藥理學抑制劑PRGL493對癌細胞進行預處理，并對荷瘤小鼠進行持續治療，結果發現PRGL493治療可減輕肺實質灌注后的癌細胞負荷，說明ACSL4在癌細胞轉移中的外溢出中起重要作用。接下來進一步研究發現敲除ACSL4可以降低細胞膜的流動性和細胞的侵襲能力。通過ARA（花生四烯酸）預處理，提高了ES-2-GFP-Luc親代細胞的PUFA脂質含量，增加了靜脈植入后小鼠的腫瘤轉移外滲率。表明ACSL4和PUFA可能通過增強轉移性癌細胞的膜流動性和侵襲性促進轉移性外滲。

圖4. ACSL4促進癌細胞外滲

6. ACSL4的促轉移作用不僅僅局限于卵巢癌

除了卵巢癌細胞系 ES-2-MC2-Hep外，使用了肝癌細胞系SK-HEP-1和乳腺癌細胞系4T1也進行了體內CRISPR篩選，結果發現，ACSL4是促進肺轉移的最重要靶點基因之一，且敲除ACSL4可以抑制SK-HEP-1細胞的肺轉移。通過ARA提高細胞中的多不飽和脂肪酸水平可以促進SK-HEP-1和4T1細胞的肺轉移。說明ACSL4在其他癌癥轉移過程中或具有功能普適性。

圖5. ACSL4的促轉移作用不僅僅局限于卵巢癌

7. 富含不飽和脂質的癌細胞依靠ECI1/ECH1在體內生長

通過體內CRISPR篩選，篩選出6個在皮下腫瘤、肝轉移瘤和肺轉移瘤中都顯著減少的sgRNA，它們靶向的基因包括MDH1、ABHD6、ECH1、ECI1、ATP5E和B3GNT4。進一步敲除ABHD6、ECI1、ECH1或MDH1可以抑制卵巢癌細胞系ES-2-MC2-Hep和腎癌細胞系769-P的皮下腫瘤生長。為了評估ECI1和ECH1這兩種在UFAs（不飽和脂肪酸）預降解過程中所特有的酶是否確實是脂肪酸β氧化所必需的，進行了Seahorse分析，結果發現敲除ECI1或ECH1可以抑制ES-2-MC2-Hep細胞對ARA的呼吸利用。利用公共數據TCGA數據集發現，ABHD6、ECI1、ECH1和MDH1 mRNA的高表達水平與卵巢癌患者的預后不良相關，這表明UFA  β-氧化途徑的促腫瘤作用可能與人類癌癥有關。

圖6. 富含不飽和脂質的癌細胞依靠ECI1/ECH1在體內生長

8. 雙重抑制ACSL4和ECH1抑制腫瘤轉移

利用CRISPR-Cas9技術敲除ACSL4和ECH1基因，構建雙敲除 (DKO) ES-2-MC2-Hep細胞系，發現靜脈植入DKO細胞與ACSL4或ECH1單缺失的細胞相比，在注射后21天的肺轉移負荷更低。并且在敲除ACSL4的ES-2-MC2-Hep細胞中ECH1蛋白升高。在黑色素瘤細胞B16-F10細胞中，ACSL4/ECH1的DKO可以抑制肺轉移，表明聯合靶向UFA的酯化和β-氧化可能是治療轉移性腫瘤的有效策略。

圖7. 雙重抑制ACSL4和ECH1抑制腫瘤轉移

小結

控制轉移是癌癥治療中一個持續的挑戰，本研究揭示了癌細胞轉移潛力與鐵死亡敏感性之間的相關性，通過在小鼠模型中進行的代謝聚焦CRISPR篩選，發現ACSL4是促進血液轉移的關鍵因素，其通過增強膜流動性和細胞侵襲性來促進癌細胞的外滲。此外，研究還發現，富含PUFA的癌細胞在體內生長時依賴于ECI1/ECH1進行β-氧化。這些發現為未來的治療干預提供了新的靶點，有望改善轉移性癌癥患者的預后。

參考文獻

ACSL4 and polyunsaturated lipids support metastatic extravasation and colonization. Cell. 2024.

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