RRBS揭示中藥材DNA甲基化變化及花粉調控種子休眠的表觀遺傳機制
滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）是一種著名的中藥材，其花藥在花粉成熟后表現出獨特的周期性開裂和閉合的生理特性。其種子具有“次生休眠”特性，導致發芽率低、繁殖效率差。種子休眠受植物激素（如赤霉素和脫落酸）含量及比例影響，而這些激素的合成基因表達又受溫度、光照和種子含水量等因素調控。此外，滇重樓的花藥在花粉成熟后會出現獨特的周期性開裂和閉合現象，但這種現象對種子休眠的調控機制尚不清楚。
近日，昆明學院農學與生命科學學院王斌教授團隊通過RNA測序和DNA甲基化測序，比較了花粉和種子在花藥開裂與閉合過程中的基因表達和甲基化變化，并結合不同花粉授粉模型，分析了這些變化對種子休眠的調控機制。相關研究成果以“Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy”為題發表在《Frontiers in Plant Science》期刊。
研究人員結合RNA測序（RNA-seq）和簡化基因組DNA甲基化測序（RRBS）技術，分析了花藥開裂和閉合過程中花粉和種子的基因表達譜以及甲基化變化，并研究了低溫處理后的影響。通過KEGG通路富集分析，鑒定出溫度相關甲基化變化敏感的基因簇（clusters）。
研究設置四種花粉處理模型：正常對照組、“低溫保護花粉”組、“剛開裂花藥的花粉”組和“閉合阻斷花藥的花粉”組，通過人工授粉產生相應的種子。隨后利用qRT-PCR技術驗證在不同處理條件下，授粉種子中標記基因表達模式變化。
通過轉錄組分析，研究者鑒定出花藥與正常組織之間的差異顯著表達基因，以及與低溫處理花粉和種子相關的甲基化變化基因區域。氧化磷酸化（ko00190）、植物激素信號轉導（ko04075）和玉米素生物合成（ko00908）三條信號通路表現出顯著的基因表達和甲基化變化富集。尤其是NADH-泛醌氧化還原酶鏈5、質膜ATP酶4、細胞色素c氧化酶亞基2、玉米素-O-葡萄糖基轉移酶、ABA不敏感蛋白5類似蛋白4和吲哚-3-乙酸酰胺合成酶（IAAS）等被鑒定為易受溫度誘導的甲基化變化影響的基因簇。
不同花粉授粉模型的評估結果顯示，IAAS、蔗糖合成酶（SUS）、赤霉素2-氧化酶（GA2ox）、ABA不敏感蛋白2（ABI2）和生長素抑制蛋白（ARP）這五個與休眠調控相關的標記基因在閉合阻斷花藥的花粉、低溫保護的花粉以及剛開裂花藥的花粉三種情況均表現出差異表達模式。閉合阻斷花藥處理導致IAAS、SUS、GA2ox和ABI2的表達顯著上調，而ARP表達則顯著下調，這表明閉合阻斷花藥處理傾向于延長種子休眠期。而在低溫保護的花藥模型中，SUS、ARP、GA2ox和IAAS的表達水平降低，ABI2表達上調，總體上促進種子萌發。
研究方法及結果
樣本收集：滇重樓的花藥、花粉粒和種子
研究方法及結果：
1. 轉錄組分析：發現花藥開裂和閉合狀態的基因表達存在顯著差異，閉合花藥中基因表達水平更高，且與能量代謝和植物激素信號轉導相關的基因顯著富集。
2. DNA甲基化分析：對不同處理的花粉和種子進行RRBS分析，檢測DNA甲基化變化。RRBS結果顯示，低溫處理的花粉和種子中，氧化磷酸化、植物激素信號和玉米素生物合成等通路中的基因易發生甲基化變化。
3. 基因表達與甲基化的關聯分析：低溫處理導致花粉和種子中某些基因的甲基化水平發生變化，進而影響其表達水平。例如，NADH-泛醌氧化還原酶鏈5（ND5）、質膜ATP酶4（AHA4）和細胞色素c氧化酶亞基2（COX2）等基因在低溫處理后表達上調，而IAA-酰胺合成酶（IAAS）等基因表達下調。
4. 花粉處理模型對種子休眠的影響：通過人工授粉實驗發現，不同處理花粉模型（如低溫保護、阻止花藥閉合等）顯著改變了種子中與休眠調控相關的基因表達模式，如SUS、ARP、IAAS、GA2ox和ABI2等基因的表達水平發生變化，進而影響種子的休眠與萌發。
RRBS在本研究中發揮關鍵作用
1. 檢測DNA甲基化變化：RRBS用于分析低溫處理對花粉和種子基因組DNA甲基化的影響，揭示了氧化磷酸化、植物激素信號等通路中的基因甲基化變化。
2. 關聯基因表達與甲基化：通過RRBS分析，研究者發現低溫處理導致的甲基化變化與基因表達的調控密切相關，如ND5、AHA4和COX2等基因的甲基化水平變化與其表達上調一致，而IAAS等基因的甲基化變化則與其表達下調相關。
3. 揭示環境因素對基因調控的影響：RRBS結果表明，低溫作為一種環境因素，可以通過改變花粉和種子中特定基因的甲基化狀態，進而影響其表達，從而調控種子的休眠與萌發，為理解環境因素對植物基因表達和發育的調控機制提供了重要依據。
關鍵結果圖形
本研究采用RRBS分析滇重樓花粉和種子的全基因組甲基化情況，構建的滇重樓RRBS文庫經亞硫酸鹽處理，非甲基化C到T的轉化率超97%。測序分析結果顯示，經過4°C低溫處理的花粉（4-H）和25°C處理的花粉（25-H）分別產生46.68 Gb和34.22 Gb的數據，而經過-85°C處理的種子（85-Z）和4°C處理的種子（4-Z）分別產生71.76 Gb和74.4 Gb的數據（表1）。
表1：低溫處理花粉和種子甲基化測序結果的質控數據
圖1：從轉錄組比較中差異表達基因富集的KEGG通路與差異DNA甲基化基因富集的通路重疊。
A. 開花藥組（T1–T3）與正常組織（T12–T15）的差異基因富集分析顯示，最顯著KEGG通路是植物激素信號（Ko04075）。
B. 閉花藥組（T4–T6）與正常組織（T12–T15）的差異基因富集分析表明，最顯著KEGG通路是淀粉和蔗糖代謝以及氧化磷酸化（Ko00190）。
C. 開花藥組（T1–T3）與閉花藥組（T4–T6）的差異基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最顯著KEGG通路。
D. 4°C和25°C不同溫度處理的花藥甲基化差異基因富集分析表明，最顯著KEGG通路是氧化磷酸化（Ko00190）。
E. -85°C和4°C不同溫度處理的種子甲基化差異基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最顯著通路之一。
F. 轉錄組和甲基化分析中富集的重疊通路分析表明，影響花粉發育基因表達的關鍵酶因溫度下降而發生甲基化變化，這與種子的行為一致。
酶1（enzyme1）：NADH-泛醌氧化還原酶鏈5；酶2：質膜ATP酶4；酶3：細胞色素c氧化酶亞基2；酶4：玉米素-O-葡萄糖基轉移酶；酶5：ABA不敏感蛋白5類似蛋白4；酶6：吲哚-3-乙酸酰胺合成酶。
圖2：花粉和種子中易發生甲基化變化的基因可能通過農業和生物學中的信號通路影響種子休眠。
易小結：研究亮點
1. 揭示花藥開裂與閉合的基因表達差異：首次系統地分析了滇重樓花藥開裂和閉合狀態下的基因表達差異，發現閉合花藥中與能量代謝相關的基因表達顯著上調。
2. 低溫對花粉和種子甲基化的調控機制：明確了低溫處理通過改變花粉和種子中特定基因的甲基化水平，進而影響其表達，為理解環境因素對種子休眠的調控提供了新的視角。
3. 花粉處理對種子休眠的調控作用：通過不同花粉處理模型，證實了花粉的生理狀態和環境處理可以通過改變種子中關鍵基因的表達模式來調控種子的休眠與萌發，為滇重樓的人工繁殖提供了新的思路。
參考文獻：Wang M, Wang Q, Wang X, Wang D, Yin X,Qiao Y, Ma M, Du Y and Wang B (2024) Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy.Front. Plant Sci. 15:1389357.doi: 10.3389/fpls.2024.1389357
近日，昆明學院農學與生命科學學院王斌教授團隊通過RNA測序和DNA甲基化測序，比較了花粉和種子在花藥開裂與閉合過程中的基因表達和甲基化變化，并結合不同花粉授粉模型，分析了這些變化對種子休眠的調控機制。相關研究成果以“Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy”為題發表在《Frontiers in Plant Science》期刊。
研究設置四種花粉處理模型：正常對照組、“低溫保護花粉”組、“剛開裂花藥的花粉”組和“閉合阻斷花藥的花粉”組，通過人工授粉產生相應的種子。隨后利用qRT-PCR技術驗證在不同處理條件下，授粉種子中標記基因表達模式變化。
通過轉錄組分析，研究者鑒定出花藥與正常組織之間的差異顯著表達基因，以及與低溫處理花粉和種子相關的甲基化變化基因區域。氧化磷酸化（ko00190）、植物激素信號轉導（ko04075）和玉米素生物合成（ko00908）三條信號通路表現出顯著的基因表達和甲基化變化富集。尤其是NADH-泛醌氧化還原酶鏈5、質膜ATP酶4、細胞色素c氧化酶亞基2、玉米素-O-葡萄糖基轉移酶、ABA不敏感蛋白5類似蛋白4和吲哚-3-乙酸酰胺合成酶（IAAS）等被鑒定為易受溫度誘導的甲基化變化影響的基因簇。
不同花粉授粉模型的評估結果顯示，IAAS、蔗糖合成酶（SUS）、赤霉素2-氧化酶（GA2ox）、ABA不敏感蛋白2（ABI2）和生長素抑制蛋白（ARP）這五個與休眠調控相關的標記基因在閉合阻斷花藥的花粉、低溫保護的花粉以及剛開裂花藥的花粉三種情況均表現出差異表達模式。閉合阻斷花藥處理導致IAAS、SUS、GA2ox和ABI2的表達顯著上調，而ARP表達則顯著下調，這表明閉合阻斷花藥處理傾向于延長種子休眠期。而在低溫保護的花藥模型中，SUS、ARP、GA2ox和IAAS的表達水平降低，ABI2表達上調，總體上促進種子萌發。
研究方法及結果
樣本收集：滇重樓的花藥、花粉粒和種子
研究方法及結果：
1. 轉錄組分析：發現花藥開裂和閉合狀態的基因表達存在顯著差異，閉合花藥中基因表達水平更高，且與能量代謝和植物激素信號轉導相關的基因顯著富集。
2. DNA甲基化分析：對不同處理的花粉和種子進行RRBS分析，檢測DNA甲基化變化。RRBS結果顯示，低溫處理的花粉和種子中，氧化磷酸化、植物激素信號和玉米素生物合成等通路中的基因易發生甲基化變化。
3. 基因表達與甲基化的關聯分析：低溫處理導致花粉和種子中某些基因的甲基化水平發生變化，進而影響其表達水平。例如，NADH-泛醌氧化還原酶鏈5（ND5）、質膜ATP酶4（AHA4）和細胞色素c氧化酶亞基2（COX2）等基因在低溫處理后表達上調，而IAA-酰胺合成酶（IAAS）等基因表達下調。
4. 花粉處理模型對種子休眠的影響：通過人工授粉實驗發現，不同處理花粉模型（如低溫保護、阻止花藥閉合等）顯著改變了種子中與休眠調控相關的基因表達模式，如SUS、ARP、IAAS、GA2ox和ABI2等基因的表達水平發生變化，進而影響種子的休眠與萌發。
RRBS在本研究中發揮關鍵作用
1. 檢測DNA甲基化變化：RRBS用于分析低溫處理對花粉和種子基因組DNA甲基化的影響，揭示了氧化磷酸化、植物激素信號等通路中的基因甲基化變化。
2. 關聯基因表達與甲基化：通過RRBS分析，研究者發現低溫處理導致的甲基化變化與基因表達的調控密切相關，如ND5、AHA4和COX2等基因的甲基化水平變化與其表達上調一致，而IAAS等基因的甲基化變化則與其表達下調相關。
3. 揭示環境因素對基因調控的影響：RRBS結果表明，低溫作為一種環境因素，可以通過改變花粉和種子中特定基因的甲基化狀態，進而影響其表達，從而調控種子的休眠與萌發，為理解環境因素對植物基因表達和發育的調控機制提供了重要依據。
關鍵結果圖形
本研究采用RRBS分析滇重樓花粉和種子的全基因組甲基化情況，構建的滇重樓RRBS文庫經亞硫酸鹽處理，非甲基化C到T的轉化率超97%。測序分析結果顯示，經過4°C低溫處理的花粉（4-H）和25°C處理的花粉（25-H）分別產生46.68 Gb和34.22 Gb的數據，而經過-85°C處理的種子（85-Z）和4°C處理的種子（4-Z）分別產生71.76 Gb和74.4 Gb的數據（表1）。
表1：低溫處理花粉和種子甲基化測序結果的質控數據
圖1：從轉錄組比較中差異表達基因富集的KEGG通路與差異DNA甲基化基因富集的通路重疊。
B. 閉花藥組（T4–T6）與正常組織（T12–T15）的差異基因富集分析表明，最顯著KEGG通路是淀粉和蔗糖代謝以及氧化磷酸化（Ko00190）。
C. 開花藥組（T1–T3）與閉花藥組（T4–T6）的差異基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最顯著KEGG通路。
D. 4°C和25°C不同溫度處理的花藥甲基化差異基因富集分析表明，最顯著KEGG通路是氧化磷酸化（Ko00190）。
E. -85°C和4°C不同溫度處理的種子甲基化差異基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最顯著通路之一。
F. 轉錄組和甲基化分析中富集的重疊通路分析表明，影響花粉發育基因表達的關鍵酶因溫度下降而發生甲基化變化，這與種子的行為一致。
酶1（enzyme1）：NADH-泛醌氧化還原酶鏈5；酶2：質膜ATP酶4；酶3：細胞色素c氧化酶亞基2；酶4：玉米素-O-葡萄糖基轉移酶；酶5：ABA不敏感蛋白5類似蛋白4；酶6：吲哚-3-乙酸酰胺合成酶。
表2：低溫處理種子和花粉中 Methyl-Diff 基因和代謝通路的重疊分析。
圖3：驗證受精種子中花粉表達變化的基因
易小結：研究亮點
1. 揭示花藥開裂與閉合的基因表達差異：首次系統地分析了滇重樓花藥開裂和閉合狀態下的基因表達差異，發現閉合花藥中與能量代謝相關的基因表達顯著上調。
2. 低溫對花粉和種子甲基化的調控機制：明確了低溫處理通過改變花粉和種子中特定基因的甲基化水平，進而影響其表達，為理解環境因素對種子休眠的調控提供了新的視角。
3. 花粉處理對種子休眠的調控作用：通過不同花粉處理模型，證實了花粉的生理狀態和環境處理可以通過改變種子中關鍵基因的表達模式來調控種子的休眠與萌發，為滇重樓的人工繁殖提供了新的思路。
參考文獻：Wang M, Wang Q, Wang X, Wang D, Yin X,Qiao Y, Ma M, Du Y and Wang B (2024) Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy.Front. Plant Sci. 15:1389357.doi: 10.3389/fpls.2024.1389357
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DNA甲基化
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