MeRIP-seq揭示METTL3特異性重編程m6A RNA甲基化修飾并促進腫瘤進展
N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA上最常見的化學修飾之一，對基因表達調控至關重要。METTL3和METTL14形成的異二聚體復合體（METTL3-METTL14復合體）是mRNA上m6A修飾的主要催化酶。已有研究表明，METTL3-METTL14異常表達與多種癌癥的發生發展有關，但其突變如何影響甲基化特異性尚不明確。此外，METTL14的R298位點（METTL14R298P）是癌癥中最常突變的位點之一，傳統認為其導致功能缺失，但其功能尚未完全闡明。
近日，美國得克薩斯大學西南醫學中心Yunsun Nam團隊揭示了癌癥相關突變如何通過改變METTL3-METTL14復合體對RNA甲基化（m6A）的特異性來促進腫瘤發生。研究發現，METTL14的R298P突變能夠改變m6A的序列偏好，優先修飾含有GGAU motif的非典型位點，導致非典型m6A修飾位點累積，激活促癌通路（如WNT信號），從而促進細胞遷移、侵襲和腫瘤生長。這一發現為理解癌癥中RNA修飾的調控機制提供了新視角，并為開發癌癥靶向治療提供了潛在新靶點。相關研究成果以“Cancer mutations rewire the RNA methylation specificity of METTL3-METTL14”為題發表于《SCIENCE ADVANCES》期刊。
標題：Cancer mutations rewire the RNA methylation specificity of METTL3-METTL14（癌癥突變重新連接METTL3-METTL14的RNA甲基化特異性）
發表時間：2024年12月20日
發表期刊：SCIENCE ADVANCES（Sci Adv）
影響因子：IF 11.7 / 1區
技術平臺：MeRIP-seq（m6A-seq）、RNA-seq、IVM-seq（體外甲基化測序）
RNA的化學修飾對轉錄后基因調控至關重要。METTL3-METTL14復合體負責mRNA中大部分N6-甲基腺苷（m6A）修飾的生成，而甲基轉移酶表達失調與癌癥的發生密切相關。本研究發現，m6A修飾的序列偏好變化可以促進癌變。研究結果表明，癌癥患者的METTL14R298P錯義突變體在體外培養和轉基因小鼠模型中均表現出增強的惡性細胞生長能力，但并未導致mRNA中整體m6A水平上升。該突變甲基轉移酶在體內外優先修飾含有GGAU motif的非典型位點。與典型位點類似，GGAU背景下的m6A修飾能夠被YTH家族的reader蛋白識別，但其被去甲基化酶ALKBH5去除的效率較低。結合生化和結構數據，作者提出了METTL3-METTL14如何選擇特定RNA序列進行甲基化的模型。本研究強調了序列特異性m6A修飾的重要性，并揭示了GGAU甲基化增加可促進癌變。
研究摘要：異常調控的METTL3-METTL14會導致不同的m6A修飾狀態
研究方法
前期實驗：
l 通過細胞遷移和侵襲實驗評估不同METTL14突變對細胞行為的影響。
機制探索：
結果圖形
（1）METTL14R298P導致培養物和小鼠中的惡性細胞生長
圖1. METTL14R298P在體外培養和小鼠模型中均促進惡性細胞生長。
A-B. 表達EGFP或EGFP-METTL14變體（WT、R298P或D312A）的HepG2穩定細胞系的細胞遷移（A）和侵襲（B）實驗。
C. HDT分析的小鼠腫瘤發生實驗示意圖。
D. 注射后42天的84天小鼠的肝臟與體重比值，來自2-3個實驗組（14只WT、10只R298P、7只D312A）。
E. 腫瘤發生實驗中小鼠肝臟的顯微照片。
F. 代表性完整肝臟和腫瘤組織圖像。
G-H. 通過IPA對RNA-seq（n=3）數據進行的差異表達分析，包括典型通路（G）和疾病與功能（H）模塊。
I-J. 對WNT通路（I）和細胞運動（J）的差異表達轉錄本進行定量逆轉錄PCR分析。
（2）METTL14R298P促進轉錄組中不同位點的m6A修飾
B. 對每個細胞系的特異性m6A位點進行的motif分析（紅色數字對應A）。方框中顯示了第四個位置處Cyt（胞嘧啶）和Ura（尿嘧啶）的概率百分比。
C. 與EGFP相比的m6A-seq peaks。上方展示了peaks信號比較的工作流程示意圖。數據顯示為中位數和四分位數，其中WT為33549，R298P為28892，D312A為26703。括號標記了頂部或底部的5個百分位數。
D. 對TOP 5%的甲基化位點進行motif分析（藍色括號對應C）。
E. 顯示METTL14R298P特異性peaks（粉色）的示例轉錄本的瀏覽器軌跡。標記了peak位點（粉色刻度）、序列和甲基化位點（彩色）。
F. 對至少包含一個R298P細胞特異性m6A peaks（圖2A）和一個較高的m6A峰（相對EGFP的前5%）（圖2C）的基因（n=258）進行的GO分析。
（3）METTL14R298P偏好非典型GGAU序列
B. 對METTL3-METTL14復合體變體甲基化RNA進行IVM-seq input的motif分析。
C. 重編程METTL3-METTL14變體對源MALAT1（在第4個或第5位點有單個核苷酸變化）的一系列RNA片段的體外甲基化活性分析。
D. 每個METTL14變體對GGAU底物相對于GGAC的體外甲基化活性。
E. 在不同序列和結構下RNA底物的體外甲基化。
（4）METTL14R298P生成的m6A修飾對ALKBH5去甲基化更具抗性
C-D. FTO和ALKBH5對甲基化RNA（0.5 μM）的體外去甲基化活性的定量分析。
（5）METTL14R298P RNA特異性改變的結構基礎
B-C. METTL3-METTL14復合體晶體結構在結合點附近的特寫視圖。
D. 使用含有GGAC或GGAU的RNA對指示的突變蛋白進行體外甲基化實驗。
E. RNA（粉色）的模型，包含待甲基化為m6A的腺苷（Ade）和下一個核苷酸，與WT METTL3（綠色或淺藍色）和METTL14WT（橙色）或METTL14R298P（灰色）復合體的疊加結構結合。通過觀察到的側鏈重排，可以區分胞嘧啶（Cyt）或尿嘧啶（Ura）中嘧啶環的第3和第4位（白色）（右側顯示化學結構）。
易小結
本研究首次揭示了METTL14R298P突變通過改變m6A修飾的序列偏好促進腫瘤發生的新機制。研究首先結合多種技術平臺，從細胞、分子和動物模型層面系統研究了METTL14突變的功能。隨后通過結構生物學和生物化學方法，揭示了METTL3-METTL14復合體識別RNA序列的分子機制。研究揭示了非典型m6A修飾在癌癥中的重要作用，為開發新的癌癥治療靶點提供了理論基礎。
1) 細胞和動物模型驗證：
o METTL14R298P突變顯著增強了細胞的遷移和侵襲能力。
o 在動物模型中，表達METTL14R298P的細胞形成的腫瘤更大、更頻繁，且具有更高的肝組織替代率。
o 這些非典型m6A修飾能夠被YTH家族reader蛋白識別，但對ALKBH5去甲基化酶的敏感性降低。
o R298P突變通過增加GGAU位點的甲基化，影響WNT信號通路和細胞運動相關基因的表達。
MeRIP-seq在本研究中的重要作用
l 檢測m6A修飾位點：通過MeRIP-seq，研究者全面分析了不同METTL14突變對m6A修飾圖譜的影響，揭示了R298P突變導致的m6A修飾位點偏好性改變。
l 發現非典型修飾位點：MeRIP-seq幫助研究者發現METTL14R298P突變優先修飾含有GGAU motif的非典型位點，這一發現是本研究的核心突破。
關聯基因表達與m6A修飾：結合RNA-seq數據，MeRIP-seq結果幫助研究者分析m6A修飾變化與基因表達之間的關聯，揭示了突變對WNT信號通路和細胞運動相關基因表達的影響。
參考文獻：
Zhang C, Scott RL, Tunes L, Hsieh MH, Wang P, Kumar A, Khadgi BB, Yang YY, Doxtader Lacy KA, Herrell E, Zhang X, Evers B, Wang Y, Xing C, Zhu H, Nam Y. Cancer mutations rewire the RNA methylation specificity of METTL3-METTL14. Sci Adv. 2024 Dec 20;10(51):eads4750. doi: 10.1126/sciadv.ads4750.
近日，美國得克薩斯大學西南醫學中心Yunsun Nam團隊揭示了癌癥相關突變如何通過改變METTL3-METTL14復合體對RNA甲基化（m6A）的特異性來促進腫瘤發生。研究發現，METTL14的R298P突變能夠改變m6A的序列偏好，優先修飾含有GGAU motif的非典型位點，導致非典型m6A修飾位點累積，激活促癌通路（如WNT信號），從而促進細胞遷移、侵襲和腫瘤生長。這一發現為理解癌癥中RNA修飾的調控機制提供了新視角，并為開發癌癥靶向治療提供了潛在新靶點。相關研究成果以“Cancer mutations rewire the RNA methylation specificity of METTL3-METTL14”為題發表于《SCIENCE ADVANCES》期刊。
標題：Cancer mutations rewire the RNA methylation specificity of METTL3-METTL14（癌癥突變重新連接METTL3-METTL14的RNA甲基化特異性）
發表時間：2024年12月20日
發表期刊：SCIENCE ADVANCES（Sci Adv）
影響因子：IF 11.7 / 1區
技術平臺：MeRIP-seq（m6A-seq）、RNA-seq、IVM-seq（體外甲基化測序）
RNA的化學修飾對轉錄后基因調控至關重要。METTL3-METTL14復合體負責mRNA中大部分N6-甲基腺苷（m6A）修飾的生成，而甲基轉移酶表達失調與癌癥的發生密切相關。本研究發現，m6A修飾的序列偏好變化可以促進癌變。研究結果表明，癌癥患者的METTL14R298P錯義突變體在體外培養和轉基因小鼠模型中均表現出增強的惡性細胞生長能力，但并未導致mRNA中整體m6A水平上升。該突變甲基轉移酶在體內外優先修飾含有GGAU motif的非典型位點。與典型位點類似，GGAU背景下的m6A修飾能夠被YTH家族的reader蛋白識別，但其被去甲基化酶ALKBH5去除的效率較低。結合生化和結構數據，作者提出了METTL3-METTL14如何選擇特定RNA序列進行甲基化的模型。本研究強調了序列特異性m6A修飾的重要性，并揭示了GGAU甲基化增加可促進癌變。
研究摘要：異常調控的METTL3-METTL14會導致不同的m6A修飾狀態
研究方法
前期實驗：
- 構建穩定表達METTL14野生型（WT）、R298P突變型和D312A突變型的HepG2肝癌細胞系。
l 通過細胞遷移和侵襲實驗評估不同METTL14突變對細胞行為的影響。
機制探索：
- 利用MeRIP-seq分析不同METTL14突變對m6A修飾圖譜的影響。
- 通過IVM-seq和SELEX實驗驗證METTL14R298P突變對RNA序列偏好的改變。
- RNA-seq與蛋白質組學：分析基因表達與通路變化。
- 利用體外甲基化和去甲基化實驗驗證突變對m6A修飾和去修飾的影響。
- 通過動物模型驗證METTL14R298P突變對腫瘤生長的影響。
結果圖形
（1）METTL14R298P導致培養物和小鼠中的惡性細胞生長
圖1. METTL14R298P在體外培養和小鼠模型中均促進惡性細胞生長。
C. HDT分析的小鼠腫瘤發生實驗示意圖。
D. 注射后42天的84天小鼠的肝臟與體重比值，來自2-3個實驗組（14只WT、10只R298P、7只D312A）。
E. 腫瘤發生實驗中小鼠肝臟的顯微照片。
F. 代表性完整肝臟和腫瘤組織圖像。
G-H. 通過IPA對RNA-seq（n=3）數據進行的差異表達分析，包括典型通路（G）和疾病與功能（H）模塊。
I-J. 對WNT通路（I）和細胞運動（J）的差異表達轉錄本進行定量逆轉錄PCR分析。
（2）METTL14R298P促進轉錄組中不同位點的m6A修飾
圖2. METTL14R298P促進轉錄組中特定RNA位點的m6A修飾。
A. 使用表達EGFP或METTL14（WT、R298P或D312A）的HepG2穩定細胞系進行m6A-seq實驗。每個細胞系的三個重復中重疊的peaks數以交集形式顯示在上方（總數，黑色字體），而經過四組比較后特有的peaks數顯示在下方（特有，紅色字體）。B. 對每個細胞系的特異性m6A位點進行的motif分析（紅色數字對應A）。方框中顯示了第四個位置處Cyt（胞嘧啶）和Ura（尿嘧啶）的概率百分比。
C. 與EGFP相比的m6A-seq peaks。上方展示了peaks信號比較的工作流程示意圖。數據顯示為中位數和四分位數，其中WT為33549，R298P為28892，D312A為26703。括號標記了頂部或底部的5個百分位數。
D. 對TOP 5%的甲基化位點進行motif分析（藍色括號對應C）。
E. 顯示METTL14R298P特異性peaks（粉色）的示例轉錄本的瀏覽器軌跡。標記了peak位點（粉色刻度）、序列和甲基化位點（彩色）。
F. 對至少包含一個R298P細胞特異性m6A peaks（圖2A）和一個較高的m6A峰（相對EGFP的前5%）（圖2C）的基因（n=258）進行的GO分析。
（3）METTL14R298P偏好非典型GGAU序列
圖3. METTL14R298P偏好非典型GGAU序列。
A. IVM-seq（體外甲基化測序）工作流程。使用帶有20個核苷酸隨機片段的寡核苷酸生成體外甲基化的RNA池。通過抗m6A抗體篩選出的甲基化RNA進行高通量測序。B. 對METTL3-METTL14復合體變體甲基化RNA進行IVM-seq input的motif分析。
C. 重編程METTL3-METTL14變體對源MALAT1（在第4個或第5位點有單個核苷酸變化）的一系列RNA片段的體外甲基化活性分析。
D. 每個METTL14變體對GGAU底物相對于GGAC的體外甲基化活性。
E. 在不同序列和結構下RNA底物的體外甲基化。
（4）METTL14R298P生成的m6A修飾對ALKBH5去甲基化更具抗性
圖4. METTL14R298P生成的m6A對ALKBH5去甲基化的抗性更強。
A-B. YTHDF2和ALKBH5與含有GGAC或GGAU的RNA（有或沒有m6A修飾）的凝膠遷移率變化（gel-shift）實驗。C-D. FTO和ALKBH5對甲基化RNA（0.5 μM）的體外去甲基化活性的定量分析。
（5）METTL14R298P RNA特異性改變的結構基礎
圖5. METTL14突變體的新型特異性結構基礎。
A. WT（野生型）METTL3-METTL14甲基轉移酶結構域的整體結構以供參考，SAM（青色）和R298側鏈以棒狀表示。B-C. METTL3-METTL14復合體晶體結構在結合點附近的特寫視圖。
D. 使用含有GGAC或GGAU的RNA對指示的突變蛋白進行體外甲基化實驗。
E. RNA（粉色）的模型，包含待甲基化為m6A的腺苷（Ade）和下一個核苷酸，與WT METTL3（綠色或淺藍色）和METTL14WT（橙色）或METTL14R298P（灰色）復合體的疊加結構結合。通過觀察到的側鏈重排，可以區分胞嘧啶（Cyt）或尿嘧啶（Ura）中嘧啶環的第3和第4位（白色）（右側顯示化學結構）。
易小結
本研究首次揭示了METTL14R298P突變通過改變m6A修飾的序列偏好促進腫瘤發生的新機制。研究首先結合多種技術平臺，從細胞、分子和動物模型層面系統研究了METTL14突變的功能。隨后通過結構生物學和生物化學方法，揭示了METTL3-METTL14復合體識別RNA序列的分子機制。研究揭示了非典型m6A修飾在癌癥中的重要作用，為開發新的癌癥治療靶點提供了理論基礎。
1) 細胞和動物模型驗證：
o METTL14R298P突變顯著增強了細胞的遷移和侵襲能力。
o 在動物模型中，表達METTL14R298P的細胞形成的腫瘤更大、更頻繁，且具有更高的肝組織替代率。
- m6A修飾圖譜分析：
o 這些非典型m6A修飾能夠被YTH家族reader蛋白識別，但對ALKBH5去甲基化酶的敏感性降低。
- 分子機制揭示：
o R298P突變通過增加GGAU位點的甲基化，影響WNT信號通路和細胞運動相關基因的表達。
MeRIP-seq在本研究中的重要作用
l 檢測m6A修飾位點：通過MeRIP-seq，研究者全面分析了不同METTL14突變對m6A修飾圖譜的影響，揭示了R298P突變導致的m6A修飾位點偏好性改變。
l 發現非典型修飾位點：MeRIP-seq幫助研究者發現METTL14R298P突變優先修飾含有GGAU motif的非典型位點，這一發現是本研究的核心突破。
關聯基因表達與m6A修飾：結合RNA-seq數據，MeRIP-seq結果幫助研究者分析m6A修飾變化與基因表達之間的關聯，揭示了突變對WNT信號通路和細胞運動相關基因表達的影響。
參考文獻：
Zhang C, Scott RL, Tunes L, Hsieh MH, Wang P, Kumar A, Khadgi BB, Yang YY, Doxtader Lacy KA, Herrell E, Zhang X, Evers B, Wang Y, Xing C, Zhu H, Nam Y. Cancer mutations rewire the RNA methylation specificity of METTL3-METTL14. Sci Adv. 2024 Dec 20;10(51):eads4750. doi: 10.1126/sciadv.ads4750.
標簽：
RNA甲基化
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