圖 1

主要技術
scRNA-seq、Visium、Xenium

研究結果
1. 人乳腺癌FFPE組織進行綜合繪圖
對乳腺癌FFPE樣本進行單細胞轉錄組測序(scFFPE-seq)，從乳腺癌組織中生成了單細胞轉錄組數據，分析獲得17個群(圖2a)。通過收集與用于scFFPE-seq的組織切片相鄰的5μm組織切片來生成Visium轉錄組數據，同樣獲得了17個群(圖2b)。通過marker基因對scFFPE-seq數據進行注釋，并將細胞類型映射到Visium數據上，其中十群注釋成具體細胞類型或疾病狀態，而其他七個群則由混合的細胞類型組成(圖2b)。通過Visium確定了三個腫瘤結構域的空間位置，根據scFFPE-seq，這些腫瘤結構域顯示為不同的集群，包括兩種分子上不同類型的導管原位癌DCIS#1、DCIS#2和浸潤性腫瘤。Visium結果還得出免疫細胞和間質細胞的大致區域(圖2c)。
 

圖 2

2. Xenium原位數據在單細胞水平上揭示腫瘤異質性
scFFPE-seq和Visium數據共同揭示了兩種不同的DCIS和肌上皮細胞類型，研究人員運用Xenium技術以更詳細的細節和更高的分辨率探索這些區域的臨近細胞。Xenium 包含人類乳腺基因組(280個基因)和33個附加基因，共313個基因。對解碼一個周期后觀察RNA熒光圖像，以高分辨率顯示了組織的詳細結構(圖3a)。對組織的進一步分析能夠從penal中選擇相關基因，以鑒定基質細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、肌上皮細胞等(圖3b)。還進行 H＆E染色(圖3c)，以便能夠與病理學家的注釋交叉參考。通過軟件進一步可視化細胞分割邊界(圖3d)，在分析的組織切片中，研究人員觀察到共167,885個細胞和36,944,521個轉錄本(Q值≥20)，每個細胞的中位轉錄本數量為166(圖3e-f)。將scFFPE-seq數據下采樣至313個基因后，發現scFFPE-seq每個細胞的中位基因數為34，而Xenium數據為62(圖3g-h)。為驗證Xenium人類乳腺癌面板的準確性，研究人員將scFFPE-seq注釋轉移到Xenium數據中，發現86%的細胞在Xenium數據中被明確識別為單一細胞類型(圖3i)。這一結果證實了Xenium能夠捕獲生物學異質性。研究人員展示了基于Xenium數據的細胞類型注釋結果，通過精確的轉錄本分配，識別出與單細胞數據相似的細胞類型，但是DCIS 亞型和增殖性腫瘤細胞沒有得到解決(圖3j-k)。這進一步證明了Xenium技術在單細胞水平上的可靠性和準確性。最后，研究人員生成了Xenium空間圖，直觀地展示了不同細胞類型在腫瘤微環境中的空間分布情況(圖3l)。
 

圖 3

3. 具有三種腫瘤亞型的乳腺癌樣本中細胞群體存在異質性
研究人員首先利用scFFPE-seq數據將三種不同的腫瘤上皮細胞亞型和兩種肌上皮亞型映射到Xenium數據中，選擇了三個感興趣的區域(ROIs)：DCIS #1、DCIS #2和浸潤性腫瘤區域進行深入研究(圖4a)。使用scFFPE-seq數據確定了15種細胞類型在ROIs中的比例，包括淋巴細胞、肌上皮細胞和浸潤性細胞等。識別出四個主要的細胞類型組成差異：ACTA2+肌上皮細胞在DCIS #2 ROI中顯著存在，在DCIS #1 ROI中較少，在浸潤性ROI中缺失，浸潤性腫瘤細胞在DCIS #2 ROI中存在，內皮細胞在浸潤性ROI中數量稍多(圖4b)。也進一步驗證了這些細胞類型組成差異，并展示了DCIS #2 ROI中ACTA2+肌上皮細胞的邊界環繞著浸潤性細胞。這表明DCIS #2 ROI比DCIS #1 ROI更具侵襲性。浸潤性ROI中浸潤性細胞類型的發生率高，肌上皮細胞類型完全缺失。Xenium的高分辨率使得能夠捕獲鄰近細胞的信息(圖4c)。七種主要細胞類型的典型標記物和腫瘤亞型之間差異表達基因的表達分析揭示了MZB1是DCIS #1 ROI的特異性標記物，GJB2+基質細胞在DCIS #2 ROI中存在，ALDH1A3、KRT15和KRT23：在DCIS #1 ROI的肌上皮細胞中高表達，MMP12為巨噬細胞標記物，在浸潤性ROI中缺失(圖4d)。
 

圖 4

4. 整合空間轉錄組數據和靶向原位數據描述了三陽性區域
本研究使用的組織塊被標注為HER2+/ER+/PR−。Xenium數據顯示，大部分區域為ERBB2+(HER2+)和雙陽性ERBB2+/ESR1+(HER2+/ER+)基因表達(圖5a)。然而，研究人員發現了一個小的三陽性ERBB2+/ESR1+/PGR+(HER2+/ER+/PR+)DCIS ROI，該區域位于脂肪細胞附近，主要由DCIS #2腫瘤上皮細胞組成，缺乏KRT15+肌上皮細胞層(圖5b-d)。接下來，研究人員比較了Xenium和scFFPE-seq數據中三種臨床上相關的受體基因的表達。發現在scFFPE-seq數據中，PGR+細胞很少，且這些細胞不共表達ESR1或ERBB2(圖5e-f)。在Visium數據中，三陽性區域僅由5-6個點表示，作為Cluster 12的一部分。發現Visium數據能夠提供全轉錄組信息，揭示了三陽性區域的基因表達特征(圖5g-h)。通過Xenium和Visium的數據，研究人員將Xenium中的轉錄本按鄰近關系分配到Visium點上，并對這五個點與其他惡性點進行全轉錄組差異表達分析。識別出48個與PGR−DCIS #1相比的差異表達基因和44個與PGR−DCIS #2相比的差異表達基因(圖5i-j)。

圖 5

5. 整合單細胞和原位數據分析肌上皮邊界的細胞
為探索數據整合策略是否可以應用于不同生物樣本中DCIS向浸潤性過渡的研究。研究人員用不同的人乳腺癌切片進行驗證，該樣本被標注為HER2+/ER−/PR−，包含正常、DCIS和浸潤性區域。使用相同Xenium penal對樣本相同處理，識別了免疫細胞、肌上皮細胞、上皮細胞和腫瘤細胞群體。在樣本中檢測到脂肪細胞、細胞毒性T細胞(CTLA4+)、漿細胞、樹突狀細胞等。兩個基質細胞群體分離成不同的簇，并且在空間上不同。對腫瘤、肌上皮細胞和巨噬細胞群體進行亞群分析，識別了增殖性(TOP2A+)、SCD+和S100A8+腫瘤細胞，以及M1、M2和CD83+巨噬細胞。發現三種上皮細胞(ESR1+、PIGR+和OPRPN+)和一種肌上皮細胞(DST+)在分子和空間上都是不同的，與scRNA-seq參考數據一致。研究人員注意到一個位于腫瘤和肌上皮細胞群體之間的亞群，這些細胞共表達腫瘤(ERBB2、ABCC11)和肌上皮細胞(MYLK、DST)標記物(圖6a)。并通過對DCIS區域的高倍鏡檢查，確認這些細胞確實共表達這兩種標記物(圖6b-c)。作為對照，研究人員觀察了正常導管區域，其中肌上皮細胞和上皮細胞緊密相鄰，但細胞類型特異性標記物沒有混合，這表明觀察結果不是由于粗略的分割錯誤(圖6d)。接下來，研究人員對Xenium數據中識別的邊界細胞群體進行了差異表達基因分析，并在樣本1的scFFPE-seq數據中尋找這種細胞類型特異性的基因表達譜，發現這些細胞中的大多數之前被注釋為肌上皮細胞，占scFFPE-seq數據中約1%的細胞。將這些細胞與腫瘤細胞和肌上皮細胞進行比較，并推導出全轉錄組信息。這導致識別出在邊界細胞中高表達的基因CX3CL1、CCL28、PROM1等，這些基因在腫瘤細胞、肌上皮細胞或任何其他共定位細胞類型中不表達(圖6e-f)。
 

圖 6

結語
本研究通過整合單細胞、空間和原位分析技術，對乳腺癌組織微環境進行了高分辨率的基因表達分析，揭示了腫瘤異質性和關鍵細胞類型的分子特征。研究使用了兩個FFPE乳腺癌組織塊，通過scFFPE-seq、Visium和Xenium技術，識別了不同的腫瘤亞型和罕見的邊界細胞群體。在樣本1中，研究人員發現了三陽性(ERBB2+/ESR1+/PGR+)DCIS區域，并識別了與侵襲性相關的分子差異。在樣本2中，研究人員識別了一種罕見的邊界細胞群體，這些細胞共表達腫瘤和肌上皮細胞標記物，可能在DCIS到浸潤性癌的過渡中起關鍵作用。這些發現展示了多技術整合在揭示腫瘤異質性方面的強大能力，為理解乳腺癌的分子機制提供了新的見解，有助于推進腫瘤學研究和診斷治療的發展。

參考文獻：
Janesick A, Shelansky R, Gottscho AD, et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 2023 Dec 19;14(1):8353. doi: 10.1038/s41467-023-43458-x. PMID: 38114474; PMCID: PMC10730913.