腫瘤類器官培養和藥敏篩選中細胞因子和抑制劑的種類及作用
癌癥并不是一種單因素的疾病，在不同個體之間甚至同一個體內部（瘤內）都存在異質性。通過實驗測試腫瘤對不同抑制劑的敏感性就成為了目前腫瘤研究的熱點之一。已有的一些技術，例如腫瘤細胞系的二維培養、異種移植等方法，往往存在造模效率不高、難以復制體內異質性、基因組欠穩定、培養周期較長等缺陷。腫瘤類器官是一種從腫瘤組織中提取的癌細胞三維培養物，在基因組和功能方面與原始細胞相似，是在器官水平上對原代組織的病理特征進行模擬，可用于腫瘤生物學的研究和藥敏篩選。AbMole提供高品質抑制劑、細胞因子、人源單抗、靶點蛋白、天然產物、熒光染料、多肽、化合物庫、抗生素，全球大量文獻專利引用。
一、腫瘤類器官的培養
腫瘤類器官的一般培養流程如圖1所示，首先是獲得腫瘤組織。隨后用胰酶、膠原酶和DNA酶消化并用培養基重懸以獲得單細胞懸液，不同腫瘤的消化時間長短有所區別。為去除未消化的細胞，還需要用特定孔徑的細胞篩過濾懸液。接著轉移至預冷的基底膜提取物（BME）中，隨后將BME與腫瘤細胞的混合物滴在預熱的懸浮細胞培養板底部，將培養板置于37℃培養箱中使BME凝固。在培養過程中常采用DMEM/F12作為基礎培養基，因其含有較為豐富的營養因子，廣泛用于增殖培養。除了基礎培養基之外，還需隨著腫瘤類型的不同而額外加入不同的細胞因子或抑制劑，但基本上都含有以下四種：
1.生長因子
類器官研究中用到的生長因子主要是酪氨酸受體激酶的配體，包括表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）（M9415）、成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，FGF）（M10353）等，上述的幾種生長因子可刺激上皮細胞增殖，促進腫瘤細胞生長。
圖1 腫瘤類器官的培養流程和藥敏篩選。
2.Wnt信號通路激活劑
Wnt信號通路是一個復雜的蛋白質作用網絡，在胚胎發育、癌癥以及成年動物的正常生理過程中均發揮著重要作用。類器官領域中的Wnt激活劑主要是R-spondin 1 （RSPO1）（M15009），RSPO1可以促進細胞的增殖與分化，從而支持類器官中多種細胞類型的形成和維持。
3.TGF-β超家族抑制劑
最常使用的TGF-β抑制劑是Noggin（M9999）和A 83-01（M5037 ），A83-01是一種有效的TGF-β的I型受體ALK5、ALK4和ALK7的抑制劑，A 83-01可以抑制腫瘤類器官的增殖，有助于維持腫瘤類器官的穩定性和長期增殖能力，這對于研究腫瘤生長機制具有重要意義。骨形態發生蛋白（BMP）是TGF-β超家族的一個重要亞類，Noggin通過抑制BMP信號通路的活性來維持腫瘤類器官中細胞的正常增殖和分化狀態。
4.ROCK抑制劑
Y27632（M1817）是類器官領域中使用最為普遍的Rho相關蛋白激酶（ROCK）的抑制劑，Y27632可以直接結合ROCK的催化位點以抑制其激酶活性，因此Y-27632可以間接抑制Rho介導的應力纖維的形成并避免細胞因過度收縮而死亡。Y27632還可以保持干細胞的干性，對于一些離體的組織，例如腫瘤組織可以通過保存在含有Y27632的溶液中以延長保存時間。
在腫瘤類器官培養完成后還需要進行鑒定，可通過組織切片、HE染色、測序分析、免疫熒光等方法去驗證腫瘤類器官與體內腫瘤的一致性以便于開展后續的藥敏篩選。AbMole是ChemBridge中國區官方指定合作伙伴。
二、腫瘤類器官的藥敏篩選
腫瘤類器官因其與在體腫瘤組織具有高度相似性，所以它可作為一種模型來測試腫瘤相關抑制劑或人源化單抗試劑的效果，通過結合高通量和自動化等技術可進一步縮短實驗時間，且通量較高，可短時間內篩選出活性較強的抑制劑或單抗試劑（圖2）。
圖2 腫瘤類器官藥敏篩選的一般流程。
腫瘤類器官的藥敏篩選的主要流程是：首選將要篩選的抑制劑配制特定濃度的儲存母液，然后按照梯度稀釋至96或者384孔板中。同時構建腫瘤類器官并將其轉入孔板中，待其培養完成后，按照設計好的布局加入抑制劑，最后分析對應孔板中的細胞活力以采集IC50、腫瘤生長抑制率等數據。
1.藥敏篩選文庫的組成
藥敏篩選的文庫一般是一些常見的抗腫瘤抑制劑或者人源化單抗試劑，并且還可以按照設計好的方案進行聯合藥敏測試。這里需注意的是由于類器官不具有完整的機體代謝能力和環境，因此待測對象一般選擇其活性形式而非前體。常見的抗腫瘤抑制劑包括：Afatinib（M1677）、Cisplatin（M2223）、Dabrafenib（M1988）、LY2157299（M1980）、Selumetinib（M1661）等，它們可以抑制DNA合成和特定的細胞生長信號通路如EGF、TGF-β等，進而促進腫瘤細胞的凋亡。人源化單抗是近些年關注度極高的腫瘤靶向產品，這種特殊設計的單克隆抗體可結合腫瘤細胞并通過多種方式發揮作用：阻斷細胞生長相關信號通路、通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性（ADCC）、阻止腫瘤細胞的免疫逃逸、抑制血管生成等。在結合基因工程手段對抗體進行人源化后進一步降低了單抗的免疫原性，其抑制效果得到了進一步的改善，目前常見于腫瘤藥敏篩選的人源化單抗試劑主要有：用于免疫檢查點抑制的納武利尤單抗（Nivolumab，M6100）、帕博利珠單抗（Pembrolizumab，M6102）和曲美木單抗（Tremelimumab，M25253），用于血管生成抑制的貝伐珠單抗（Bevacizumab，M6166），以及靶向抑制單抗如帕尼單抗（Panitumumab，M1503）、 帕妥珠單抗（Pertuzumab，M6221）等。
2.細胞活力檢測
以往對二維培養的細胞進行活力檢測時常用的方法是MTT，但是對于三維體系細胞的檢測而言上述方法由于滲透不佳、分布不均等問題導致準確度較差。增強型ATP細胞活力檢測試劑盒（M55403）采用生物發光法，即利用熒光素酶與其底物熒光素之間的反應產生熒光，該反應需要消耗ATP并且發光信號的強度與ATP的量呈正比（圖3），由于ATP存在于所有代謝活躍的細胞中，而在死細胞中幾乎不存在，因此是鑒定活細胞最合適的標志物之一。增強型ATP細胞活力檢測試劑盒具有多種優點，包括：超高信號穩定性、超高靈敏度、超寬線性范圍，目前已成腫瘤類器官研究領域細胞活力檢測的最佳方案。
圖3 增強型ATP細胞活力檢測試劑盒的檢測原理。
腫瘤類器官培養常用產品：
EGF (M9415)、FGF-10/KGF-2(M10353)、Noggin(M9999)、R-spondin 1/RSPO1(M15009)、Y-27632(M1817)。
EGF (M9415)、FGF-10/KGF-2(M10353)、Noggin(M9999)、R-spondin 1/RSPO1(M15009)、Y-27632(M1817)。
腫瘤藥敏篩選（常見抑制劑）：
Afatinib(M1677)、Aldosterone(M7617)、Cabozantinib(M1757)、Carboplatin(M2288)、Capecitabine(M1963)、Cisplatin (M2223)、Dabrafenib(M1988)、Dasatinib(M1701 )、Dibenzazepine(M3523)、Enzalutamide(M1839)、Fruquintinib(M7554)、Irinotecan(M4465 )。
腫瘤藥敏篩選（人源化單抗）：
Nivolumab(M6100)、Pembrolizumab(M6102)、Tremelimumab(M25253)、Bevacizumab (M6166)、Panitumumab(M1503)、Pertuzumab(M6221)。
*本文所述抑制劑/人源單抗均為科研試劑，僅供科學實驗用途。
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