NHS活性酯熒光標記詳細步驟、常見問題及解決方案指南

瀏覽次數：201　發布日期：2025-4-17　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

標記原理
將熒光染料與蛋白，抗體及其他生物分子偶聯主要基于 NHS 酯反應化學， NHS 酯活化的熒光染料和待標記化合物在生理至弱堿性條件下（pH 7至 9）與伯胺反應，形成穩定的酰胺鍵，反應釋放出 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。從而實現與蛋白，抗體的偶聯。

圖1 NHS酯化學偶聯到伯胺的反應圖式
（R）表示具有NHS酯反應基團的熒光團
（P）表示含有伯胺的蛋白質，抗體或其他生物分子

標記前準備
1) 實驗物品準備：移液槍及一次性吸頭（0.5-10μL、2-20μL、20-200μL），恒溫孵育震蕩器，合適離心機。
2) 準備活性染料酯母液：粉末一般使用 DMSO 溶解，根據試劑的溶解性而定。母液應分裝低于-20℃保存，避免反復凍存和受潮。
3) 標記緩沖液配制：標記實驗請自行準備合適緩沖液，緩沖液應具有適宜的 pH 和成分，例如： 10-50mM 的硼酸鈉溶液，PBS或碳酸氫鈉溶液 (pH 7.5- 8.5)，應不包括Tris，氨基酸等含伯胺的物質。
4) 純化方式選擇：純化方式試實驗要求可選擇多種方式，實驗前請自行選擇純化方法。純化裝置包括 Zeba 脫鹽離心柱純化，Sephadex G-25 凝膠過濾柱純化，超濾管純化等。
注：推薦選擇超濾管純化，本司試劑盒產品配置有超濾管，超濾管使用前仔細請參看 Milipore 官網指南：Amicon Ultra-0.5 mL離心式過濾器，用于DNA和蛋白的純化及濃縮 - Sample Prep Centrifugal Filter Units (merckmillipore.com)

標記步驟
1 置換緩沖液（選擇性操作）
若您的抗體或蛋白濃度較低，或儲備在含有游離氨基的溶液中（Tris，氨基酸等含伯胺的物質），標記前請用標記緩沖液超濾置換抗體溶液。

2 標記反應量計算
每種染料標記比選擇取決于染料類型，蛋白類型和實驗目的，例如cy系列和蛋白最佳標記摩爾比在 1:4-1:20 。為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過預實驗進行摸索。每個標記反應染料的使用量取決于代標記蛋白的質量，濃度和分子量。在確定好大概摩爾標記比的情況下，使用以下公式進行計算染料投量：

● n(染料) 是標記抗體Ab或蛋白計算所用的染料摩爾量；單位 mmol
● m(染料) 是標記抗體Ab或蛋白計算所用的染料質量，單位 mg
● a是投料摩爾標記比（抗體：染料=1：n）
● m(Ab) 是待標記抗體 Ab 或蛋白的總質量，單位 mg
● M(Ab) 是抗體或蛋白的分子量，單位 Da
● M(染料) 是所用染料的分子量，單位 g/mol

計算好染料的摩爾使用量，換算為母液取用量，一般染料母液取用量不超過反應體系的 10% 。

● V(取母液體積) 是所取染料的體積，單位μL
● c(母液濃度),是存儲母液濃度，單位mM

3 以投料比 1:5（蛋白與染料的摩爾比）的標記實驗
取出儲存的 2mM 染料母液，染料恢復至室溫，抗體或蛋白溶液置于 300μL 的標記緩沖液反應體系，對于標記 0.1mg 的 IgG 抗體（150 KDa），立即取V = 5*0.1*106/（2*150000）μL=6.7μL，加入到體系內，震蕩均勻，染料可分多次加入震蕩，然后在室溫避光條件孵育 2 小時。

4 超濾純化（若使用超濾管）
標記反應完成后，轉移反應液后以 12000g 離心超濾15min，去除游離的染料，超濾過程輕輕混勻溶液，避免觸碰到膜，至少操作超濾 2 次至濾液無色，最后一次倒置內管超濾（4000g，1min），使濃縮后的樣本從超濾內管轉移到收集內管中，得到標記好的抗體即可使用，或置于 1%BSA 儲存液避光保存。

圖2 注：最佳標記比例可能根據蛋白的差異而不同，用戶可根據實際情況優化。超濾過程存在膜吸附，不影響后續使用。

標記比及濃度計算
1）每種染料的偶聯率在 50%-90%，真實標記比需借助紫外分光光度計測試計算。
2）使用紫外分光光度計掃描一定稀釋程度的樣本在 230nm~900nm 的吸收光譜，記錄A280的吸光度及染料最大吸收處的吸光度。
3）實驗過程請注意調整兩個吸光度值的大小范圍，使蛋白的 280nm 的吸光度盡量處于 0.1-1 范圍。
4）結合相關數據計算公式如下：

實際標記比總公式：

● A280是抗體在 280nm 的吸光度
● Aλmax是染料在最大吸收處的吸光度
● CF是染料對 280nm 處的吸光度的影響的校正因子，一般取0.03-0.07，參見染料信息
● εdye 和 εAntibody 是染料和抗體的摩爾消光系數，IgG 抗體 εAntibody 一般 210000 cm-1M-1，εdye 參見染料信息

蛋白濃度公式：

以 BLT 800 標記抗體為例標記比則為：

標記常見問題及解決方案
標記過程中蛋白出現帶顏色沉淀
? 蛋白與染料的投料摩爾比過高（蛋白濃度過高，染料濃度過高）
✔ 首先降低投料摩爾比，若仍出現，降低反應體系投料蛋白量和相應的染料量

? 反應體系存在使待標記物質聚沉的物質，可能是蛋白不耐受ph,鹽濃度，被標記后在體系聚沉
✔ 改變相應條件嘗試

? 染料分子結構特性的水溶性不高
✔ 選擇水溶性更高的染料，例如磺化的染料，但cy的波長碳鏈越長越高，水溶性越差，就算磺化后也會出現一點聚沉，只能通過其他方式減少聚沉

超濾純化過程蛋白出現聚沉
? 蛋白不兼容pH
✔ 調整 pH 在適合范圍

? 超濾過程蛋白濃度變化太大
✔ 注意一次標記的蛋白濃度

超濾純化過程較慢
? 轉速不合適，超濾管截留分子量選擇不當
✔ 轉速單位調為 xg 單位，若為 150KDa 的抗體，可更換超濾管 100KDa

蛋白標記比較低
? 活性染料儲存使用不當，NHS活性酯遇水活性鍵在幾分鐘或幾小時完全失活，使得無法標記
✔ 活性染料注意防潮，平衡室溫再打開

? 標記過程操作細節不當
✔ 請按照說明書調整，注意細節

? 蛋白緩沖液含有干擾組分如過量銨離子或含氨基物質
✔ 標記蛋白前正確置換緩沖液

? 光譜測定方法不準確
✔ 請按照正確的吸收光譜方法測定

較低蛋白回收率
? 超濾膜損破（轉速過高破損）或過多裝液體漏液
✔ 檢查超濾膜及管芯不要裝過多液體

? 回收蛋白不當
✔ 采取倒置離心回收蛋白

? 標記過程或超濾過程，蛋白發生聚沉
✔ 超濾過程每管降低蛋白濃度，或加入少量氯化銨（20mM）及時終止反應

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