研究結(jié)果
本研究首先通過體外分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SMAD4缺失的T細(xì)胞在僅含IL-6、無TGFβ信號時(shí)，仍能高效分化為TH17細(xì)胞，而野生型T細(xì)胞無法分化；雙敲除小鼠（同時(shí)缺失SMAD4和TGFβRII）的T細(xì)胞在IL-6單刺激下，TH17相關(guān)基因（Rorc、Il17a、Il23r等）表達(dá)顯著上調(diào)，與SMAD4缺失的T細(xì)胞結(jié)果一致。進(jìn)而又進(jìn)行了體內(nèi)功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示雙敲除小鼠脾臟和淋巴結(jié)中TH17細(xì)胞比例與野生型相當(dāng)，而單純TGFβRII敲除小鼠幾乎無TH17細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，雙敲除的T細(xì)胞分化為致病性TH17細(xì)胞的能力與野生型一致，且小鼠表現(xiàn)出類似的病理損傷。誘導(dǎo)型SMAD4缺失實(shí)驗(yàn)顯示，急性缺失 SMAD4可在無TGFβ受體信號時(shí)促進(jìn)TH17分化，證實(shí)SMAD4是抑制TH17分化的關(guān)鍵分子。以上結(jié)果表明SMAD4缺失解除TGFβ信號依賴的TH17細(xì)胞分化抑制。

圖1. SMAD4缺失導(dǎo)致在缺乏TGFβ信號的情況下TH17細(xì)胞分化。

圖S1. 在沒有SMAD4的情況下TH17細(xì)胞分化。

以上研究中發(fā)現(xiàn)無論是否存在TGFβ，SMAD4仍然與Rorc位點(diǎn)結(jié)合，作者提出TGFβ信號通路改變了SMAD4與其他蛋白質(zhì)的相互作用的假設(shè)。通過IP-MS和Co-IP發(fā)現(xiàn)，SMAD4與轉(zhuǎn)錄抑制因子SKI結(jié)合，且TGFβ刺激可顯著降低SKI蛋白水平，破壞SKI-SMAD4復(fù)合物；SMAD4突變體（無法結(jié)合SKI）失去對TH17分化的抑制能力，證實(shí)了SKI-SMAD4互作是抑制RORγt的關(guān)鍵。接著對SKI的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)SKI過表達(dá)可抑制Rorc啟動子區(qū)H3K9乙酰化，而SMAD4缺失可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，表明SKI-SMAD4復(fù)合物通過調(diào)控染色質(zhì)修飾抑制基因表達(dá)。經(jīng)TGFβ處理的野生型T細(xì)胞，Rorc啟動子H3K9乙酰化水平升高，而SMAD4缺失的T細(xì)胞在無TGFβ時(shí)仍維持高乙酰化，進(jìn)一步證明了TGFβ通過降解SKI解除去乙酰化抑制。以上結(jié)果表明，TGFβ通過降解SKI解除SMAD4介導(dǎo)的抑制。

圖3. TGFβ信號破壞SKI-SMAD4復(fù)合物，以促進(jìn)TH17細(xì)胞分化。

S3. 低劑量TGFβ下SKI的鑒定及其降解。

最后作者對SKI-SMAD4軸的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。異位表達(dá)SKI可顯著抑制野生型T細(xì)胞的TH17 分化和Rorc表達(dá)，且該抑制作用依賴SMAD4；干擾SKI表達(dá)可使野生型T細(xì)胞在無TGFβ時(shí)分化為TH17細(xì)胞，證明了SKI是TH17分化的負(fù)調(diào)控因子。體內(nèi)致病性結(jié)果顯示，過表達(dá)SKI的T細(xì)胞在EAE模型中分化為TH17細(xì)胞的能力顯著受損，而SKI缺陷細(xì)胞分化增強(qiáng)，表明SKI-SMAD4 軸在體內(nèi)調(diào)控TH17細(xì)胞的致病性分化。

圖4. SKI以SMAD4依賴的方式抑制TH17細(xì)胞分化。

圖S4. SKI和SMAD4協(xié)同抑制TH17細(xì)胞分化。

圖S5. TGFβ超家族信號克服了激活T細(xì)胞中SKI-SMAD4復(fù)合物介導(dǎo)的RORγt表達(dá)抑制，以促進(jìn)TH17細(xì)胞分化。