在生物醫(yī)學和制藥領(lǐng)域，準確檢測血液樣本中的細菌內(nèi)毒素含量對于疾病診斷、藥物安全性評估等工作是非常重要的。然而，在利用鱟試劑（LAL）對血液樣本，包括全血、血清、血漿及其成分進行檢測分析時，往往面臨諸多挑戰(zhàn)，堪稱最難處理的樣本類型之一。
 

一、血液樣本檢測干擾因素剖析
血液是一種極其復雜的生物組織，存在多種物質(zhì)，會對鱟試劑檢測造成干擾。

（一）蛋白質(zhì)的中和作用
部分血液蛋白質(zhì)能夠中和細菌內(nèi)毒素，當采用鱟試劑對血液樣本進行定量測定內(nèi)毒素濃度時，這些蛋白質(zhì)會與細菌內(nèi)毒素結(jié)合，給檢測結(jié)果帶來誤差。

（二）絲氨酸蛋白酶的干擾
血液中含有的絲氨酸蛋白酶，也會干擾鱟試劑檢測過程。這些蛋白酶呈現(xiàn)出兩種不同的干擾形式：其中一些蛋白酶會降解鱟試劑酶級聯(lián)反應(yīng)中的蛋白質(zhì)，導致出現(xiàn)抑制反應(yīng)；另一些則會激活該級聯(lián)反應(yīng)，導致出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

（三）（1,3）-β-D-葡聚糖的影響
正常血液中除蛋白質(zhì)外，還含有少量（1,3）-β-D-葡聚糖。這種物質(zhì)是真菌細胞壁的成分，會激活LAL酶級聯(lián)反應(yīng)。真菌感染會導致（1,3）-β-D-葡聚糖水平升高，即便其含量較低，若使用對（1,3）-β-D-葡聚糖敏感的LAL試劑檢測細菌內(nèi)毒素，也極易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

（四）樣本的復雜性與個體差異
此外，血液化學成分復雜多變，受患者或捐獻者生理狀態(tài)的顯著影響。而生理狀態(tài)又受制于年齡、飲食、基因構(gòu)成、健康狀況、疲勞程度、生活方式等諸多因素。因此，即便某種處理方案對多數(shù)樣本有效，仍可能存在部分樣本無法有效克服干擾的情況。

二、樣本處理的策略選擇
雖然通常需要對樣品進行一定處理，但在實施任何滅活操作前，建議先對樣品進行檢測。不同樣品的干擾程度因樣本而異，且與檢測時的稀釋度相關(guān)，有時甚至無需處理。與許多干擾LAL測試的樣品類似，對血液或血清樣本而言，稀釋樣本直至干擾消除，往往是較為有效的檢測方法。當然，通過處理樣品來中和干擾因素也具有可行性，有多種處理手段能夠使引起干擾的蛋白質(zhì)變性或失去活性。

（一）熱滅活法
熱滅活法是首先值得嘗試的處理方式，該方法不僅效果顯著，操作也相對簡便。不過，在某些情況下，熱滅活可能會影響細菌內(nèi)毒素的表觀濃度，因為加熱會增強某些蛋白質(zhì)與細菌內(nèi)毒素的結(jié)合程度。為驗證熱滅活法的有效性，可以分別檢測經(jīng)過熱滅活處理和未處理的樣本，并對比兩者結(jié)果。

（二）化學處理法
除熱滅活法外，還有一些化學處理手段，如添加酸或氯仿等，但這些方法僅在熱滅活無效時推薦使用。實踐表明，硝酸、洗滌劑、氫氧化鈉等處理方式，能夠有效降低各類全血樣本中的干擾。無論采用何種處理方法，每個檢測樣本都必須設(shè)置陽性產(chǎn)品對照，這一點至關(guān)重要。

三、試劑優(yōu)化與檢測方法的匹配
在血液或血清樣本的細菌內(nèi)毒素檢測中，需注重試劑與檢測方法的協(xié)同優(yōu)化以確保結(jié)果可靠性。

（一）試劑優(yōu)化應(yīng)對葡聚糖干擾

針對樣本中（1,3）-β-D-葡聚糖對檢測的干擾問題，科德角國際合作企業(yè)美國ACC（Associates Of Cape Cod）公司推出的Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液提供了有效解決方案。該緩沖液可與其全系列LAL試劑（涵蓋Pyrotell®凝膠法鱟試劑、Pyrotell®-T濁度法鱟試劑、Pyrochrome®顯色法鱟試劑及Chromo-LAL顯色法鱟試劑）實現(xiàn)精準適配。
 

▲Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液

Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液的作用機制是通過特定的化學物質(zhì)與（1,3）-β-D-葡聚糖結(jié)合，屏蔽葡聚糖對酶聯(lián)反應(yīng)的干擾，顯著提升細菌內(nèi)毒素檢測特異性，避免因葡聚糖引發(fā)的假陽性結(jié)果，使檢測結(jié)果更真實地反映細菌內(nèi)毒素水平。

（二）檢測方法的選擇與優(yōu)化
不同檢測方法的適用性需根據(jù)樣本特性進行選擇。
1、凝膠法：憑借高穩(wěn)定性和抗干擾能力，成為復雜生物樣本檢測的首選方案，它通過觀察鱟試劑與細菌內(nèi)毒素反應(yīng)形成凝膠的情況來判斷細菌內(nèi)毒素的存在與否及大致含量。在血液樣本檢測中，即使樣本存在一定程度的干擾物質(zhì)，凝膠法也能相對穩(wěn)定地呈現(xiàn)檢測結(jié)果。

2、顯色法：雖具備操作便捷性，但需警惕血漿/血清在405nm波長下的光學干擾。對此，采用含有重氮基連接的Pyrochrome®顯色法鱟試劑，通過生成540-550nm吸收波長的顯色產(chǎn)物，可有效規(guī)避干擾。但需要注意的是，該方法屬于終點檢測，相比動力學方法，其檢測范圍較窄。

3、光度法（含顯色/濁度法）：實施光度法（含顯色/濁度法）檢測全血樣本時，為避免血細胞造成的光學干擾，通常需要先對樣本進行離心處理。在實際操作中，光度法可能從多個稀釋度的檢測結(jié)果中得出有效數(shù)據(jù)，即陽性產(chǎn)品對照“加標”回收率在規(guī)定范圍內(nèi)，且樣品檢測結(jié)果處于標準曲線范圍內(nèi)。

然而，經(jīng)常出現(xiàn)這樣的情況：盡管不同稀釋度下的加標回收率一致，但經(jīng)稀釋校正后的細菌內(nèi)毒素濃度，會隨著未加標樣品稀釋程度的變化而改變，且濃度往往隨稀釋而升高。這表明，即便加標回收率顯示無干擾，但樣品中實際測得的細菌內(nèi)毒素情況說明干擾依然存在，添加的加標細菌內(nèi)毒素與樣品中的細菌內(nèi)毒素表現(xiàn)存在差異。此時，可通過逐級稀釋直至加標/未加標樣本濃度趨于一致；若稀釋無效，則必須探索其他處理方法來克服干擾。在沒有其他有效處理手段的情況下，合理的做法是將檢測結(jié)果報告為“大于或等于檢測到的最高細菌內(nèi)毒素濃度”。

四、綜合策略與技術(shù)支持
血液及血液衍生樣本在鱟試劑（LAL）檢測中常因干擾因素面臨挑戰(zhàn)，需通過系統(tǒng)的方法開發(fā)確定適宜檢測技術(shù)。盡管存在多種抗干擾策略，但優(yōu)先選用簡單且經(jīng)過驗證的方法更為高效，其推薦順序依次為稀釋法、熱失活法和化學處理法。此過程中，專業(yè)技術(shù)支持對檢測方案的成功至關(guān)重要，需結(jié)合樣本特性深度分析及方法學驗證，以確保結(jié)果可靠性。