摘要 目的:研究長期運動訓練對老年小鼠骨骼肌線粒體復合物 I 和復合物 Ⅳ活性的影響,并探討其機制。

方法:以C57 BL/6J雄性小鼠跑轉籠為運動方式,通過分光光度法和極譜氧電極法測定線粒體復合物 I和復合物 Ⅳ的活性。 結果:隨著小鼠年齡的增長,

骨骼肌線粒體復合物 I (NADH脫氫酶)活性顯著下降,復合物 IV (細胞色素氧化酶)活性無明顯變化。經過 8個月運動訓練的小鼠骨骼肌線粒體復合物 I及復合物 IV 活性明顯升高,顯著高于同齡對照鼠甚至高于5月齡鼠。結論:運動訓練在一定程度上致骨骼肌線粒體功能產生適應性變化。

關鍵詞:運動訓練;骨骼肌線粒體;復合物I;復合物IV

線粒體DNAmt DNA 編碼的復合物I和IV的活性隨增齡而下降明顯,但長期運動對復合物 I和 IV 的研究報道很少。本文以C57BL/6J 雄性小鼠跑轉籠為運動方式, 研究了從5月齡開始進行為期8個月的長期運動訓練對老年小鼠骨骼肌線粒體復合物 I和復合物 IV 活性的影響。

1 資料和方法

1. 1 實驗動物運動模型的建立 本研究選擇30只近交系C57BL/6J雄性小鼠為實驗對象,2月齡小鼠購自第一軍醫大學實驗動物中心。小鼠5月齡后隨機取 10只處死進行相關指標的測試,此組為5月齡鼠。隨機取10只開始運動訓練,訓練的方式為跑轉籠 ( running wheel) ,將小鼠放進直徑為17cm的帶軸承轉籠,讓其主動跑籠,第1天跑10 min ,以后每天增加10 min ,直至每天1h ,自動記錄跑籠圈數。每天跑籠1h ,每周5 d ,所有運動訓練均在動物暗周期6pm～10 pm完成,剩余10只對照組在相同時間放進轉籠,但轉籠固定不動。8個月后均達13月齡。

1. 2 主要試劑和儀器NADH、細胞色素C、抗壞血酸鈉。主要儀器有:731紫外分光光度計,氧電極,記錄儀。

1. 3 實驗方法

1. 3. 1 小鼠骨骼肌線粒體的制備 將小鼠斷頭處死取腓腸肌,剪碎后電動勻漿器勻漿, 差速離心分離線粒體。分離介質為0. 25 mol/L蔗糖, 1mmol / L EDTA , 5 mmol / L Tris - HCl(pH7.4) 。所有操作均在 4℃以下進行。1. 3. 2 線粒體復合物 I 活性的測定 參考 Schneider[1]的方法。反應體系中含 Tris - Hcl 緩沖液(p H7. 5) ,10 mmol / L 正鐵氰化鉀, 15 nmol / L NADH ,記錄 410 nm 處吸光度的下降值。酶活性以每毫克蛋白計算,摩爾消光系數為 1 030。

1. 3. 3 線粒體復合物 IV 活性的測定 通過極譜氧電極法測定密閉反應體系中氧飽和度的變化, 確定氧的消耗量, 以計算樣品中酶的活性。反應體積1. 6 ml , 25℃恒溫, 反應介質為10mmol / L磷酸鈉,pH 7. 4 ,4. 5 mmol / L抗壞血酸,2. 7 mmol / L四甲基- 對苯二胺鹽酸鹽( TEMPD) ,1 mmol / L 細胞色素 C。開動磁力攪拌器,待平衡后將線粒體懸液注入反應室,記錄儀曲線下降,根據記錄儀走紙的格數來計算酶的活力,酶活力以每秒內每分子細胞色素 C轉移的電子數(e - / s. heme a)為單位。1. 3. 4 統計處理 所有實驗數據由 Excel 統計軟件處理 , 以x ±s表示,t 檢驗。

2 結果

結果表明,對照組隨著小鼠年齡的增長,骨骼肌線粒體復合物 I (NADH脫氫酶) 活性顯著下降, 復合物 IV (細胞色素氧化酶)活性無明顯變化。經過8個月運動訓練的小鼠骨骼肌線粒體復合物 I 及復合物 IV 活性明顯升高, 顯著高于同齡對照鼠甚至高于 5月齡鼠。

3 討論

研究證實線粒體呼吸鏈上的某些酶是由線粒體DNA (mtDNA)和核DNA (nDNA)共同編碼的。由于 mt DNA 特殊的結構特點及所處的位置 (線粒體內膜,自由基產生的主要來源) 所以mt DNA很容易受到自由基損傷, 又缺乏較完善的修復機制 ,從而引起損傷積累,造成呼吸鏈酶的缺陷,影響氧化磷酸化功能[2 ,3 ],許多研究證實,mt DNA 突變隨增齡而升高,氧化磷酸化能力隨增齡而下降。許多研究表明, 線粒體的老化是細胞衰老的重要原因之一, 隨著年齡的增加, 線粒體結構和功能出現異常, 由線粒體功能下降引起的細胞能量缺損可能消弱細胞活性和細胞適應各種生理應激的能力。缺血性實驗對線粒體呼吸鏈活性的影響發現,復合物 I為最脆弱部分。有實驗表明,在衰老進程中,橫紋肌中細胞色素氧化酶活性顯著下降[ 4 ]。該酶活性下降與線粒體產生的氧化物的增加相關。進一步的研究檢測發現線粒體細胞色素氧化酶進行性和隨機的喪失與年齡相關的線粒體RNA 合成的下降有密切關系。NADH 脫氫酶有 7個亞單位是由線粒體 DNA (mtDNA) 編碼的 , 占總的蛋白質編碼區的59. 2 % , 復合物 IV 的 3個亞單位占 24. 4 %也是由 mtDNA 編碼的[ 5 ]。由于 mtDNA 在胞內的位置及其結構特性,決定了它易受線粒體氧化還原反應產生的氧自由基的攻擊, 引起 mtD2NA 的突變。尤其是隨著年齡的增長,組織中抗氧化劑隨增齡而減少時 , 體內積累的氧化損傷作用即可導致線粒體和 mtDNA的變異,從而使氧化磷酸化反應減退。氧化磷酸化缺陷時,可嚴重威脅各種器官和組織的能量需求和正常運轉, 從而產生臨床癥狀和老化相關性疾病。也正基于此, Wallace 等提出了 mtD2NA 突變導致衰老和老年退化病的假說[6 ]。近期有關運動與衰老的研究表明, 運動訓練可提高衰老大鼠線粒體基質酶及呼吸酶活性[7 ,8 ]。Tate 等人的研究表明衰老大鼠心肌細胞色素氧化酶活性與成年大鼠相比明顯下降, 8～10周跑臺訓練后,該酶活性顯著提高[8 ]。衰老個體線粒體酶活性的提高直接反映了線粒體功能的改善。本研究通過對小鼠長達 8個月的訓練 , 發現長期有氧運動對骨骼肌線粒體復合物 I活性無影響,但卻使復合物 IV 活性明顯升高。由此可見,運動訓練在一定程度上致骨骼肌線粒體功能產生適應性變化。根據本實驗室對骨骼肌線粒體抗氧化能力的研究結果 (另文發表)分析, 長期運動訓練通過誘導抗氧化酶活性的升高, 及時清除氧自由基, 減少其對生物大分子如核酸、蛋白質及脂類的氧化損傷,mtDNA 結構的完整有利于其編碼的酶活性的表達。有實驗發現, 骨骼肌線粒體呼吸鏈活性隨增齡而逐漸下降, mtDNA突變率卻逐漸升高, 推測體細胞隨增齡而出現 mtDNA 突變是呼吸鏈酶活性下降的可能原因之一。運動訓練可提高mtDNA編碼的 mRNA (細胞色素 b ,復合物IV亞單位I ,復合物I亞單