WB結(jié)果中雜帶較多及信號(hào)問(wèn)題解析參考
1、WB結(jié)果中雜帶較多
可能的原因及建議：
①目的蛋白存在多個(gè)修飾位點(diǎn)(磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)等等)，本身可以出現(xiàn)多條帶。查文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，去除修蛋白飾后確定蛋白實(shí)際大小，這個(gè)需要一定的生物化學(xué)基礎(chǔ)和生信分析能力。
②目的蛋白有其它剪切本，查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析其可能性。
③樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解，加入蛋白酶抑制劑；樣本處理在冰上操作。
④上樣量過(guò)高，過(guò)于敏感，適當(dāng)減少上樣量。
⑤一抗特異性不高，重新選擇或制備高特異性的抗體。
⑥一抗不純，純化抗體。
⑦一抗或者二抗?jié)舛绕撸m當(dāng)降低抗體濃度。
2、WB結(jié)果中無(wú)信號(hào)或顯示信號(hào)弱
可能的原因及建議：
①你所檢測(cè)的樣本中不表達(dá)目的蛋白，選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性，同時(shí)查閱文獻(xiàn)。
②檢測(cè)樣本低表達(dá)目的蛋白，提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
③轉(zhuǎn)移不完全或過(guò)轉(zhuǎn)移，可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠(考馬斯亮藍(lán))后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過(guò)頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。
④抗體不能識(shí)別測(cè)試種屬的相關(guān)蛋白，購(gòu)買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說(shuō)明書，確定其是否能夠交叉識(shí)別測(cè)試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白。
⑤一抗孵育時(shí)間不足，建議4℃結(jié)合過(guò)夜。
⑥二抗與一抗不匹配，選擇針對(duì)一抗來(lái)源的種屬的抗體。
⑦洗膜過(guò)度，洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，加入的去垢劑不宜過(guò)強(qiáng)或過(guò)多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。
可能的原因及建議：
①目的蛋白存在多個(gè)修飾位點(diǎn)(磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)等等)，本身可以出現(xiàn)多條帶。查文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，去除修蛋白飾后確定蛋白實(shí)際大小，這個(gè)需要一定的生物化學(xué)基礎(chǔ)和生信分析能力。
②目的蛋白有其它剪切本，查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析其可能性。
③樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解，加入蛋白酶抑制劑；樣本處理在冰上操作。
④上樣量過(guò)高，過(guò)于敏感，適當(dāng)減少上樣量。
⑤一抗特異性不高，重新選擇或制備高特異性的抗體。
⑥一抗不純，純化抗體。
⑦一抗或者二抗?jié)舛绕撸m當(dāng)降低抗體濃度。
2、WB結(jié)果中無(wú)信號(hào)或顯示信號(hào)弱
可能的原因及建議：
①你所檢測(cè)的樣本中不表達(dá)目的蛋白，選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性，同時(shí)查閱文獻(xiàn)。
②檢測(cè)樣本低表達(dá)目的蛋白，提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
③轉(zhuǎn)移不完全或過(guò)轉(zhuǎn)移，可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠(考馬斯亮藍(lán))后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過(guò)頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。
④抗體不能識(shí)別測(cè)試種屬的相關(guān)蛋白，購(gòu)買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說(shuō)明書，確定其是否能夠交叉識(shí)別測(cè)試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白。
⑤一抗孵育時(shí)間不足，建議4℃結(jié)合過(guò)夜。
⑥二抗與一抗不匹配，選擇針對(duì)一抗來(lái)源的種屬的抗體。
⑦洗膜過(guò)度，洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，加入的去垢劑不宜過(guò)強(qiáng)或過(guò)多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。
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