質(zhì)粒提取主要方法介紹
質(zhì)粒提取，作為分子生物學(xué)研究中的一項基礎(chǔ)且至關(guān)重要的技術(shù)，其過程精確而復(fù)雜。這一技術(shù)主要用于從大腸桿菌等宿主細胞中分離并純化出質(zhì)粒DNA，以便進行后續(xù)的基因克隆、轉(zhuǎn)化和表達等實驗。質(zhì)粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。
1、堿裂解法
原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學(xué)。
結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細菌蛋白質(zhì)、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
2、煮沸法裂解
將細菌懸浮于含Triton X-100
和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結(jié)構(gòu)，當溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
煮沸裂解法：
對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質(zhì)粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法
由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機械力質(zhì)粒DNA會變性，機械力消失后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性快，仍溶于溶液而細菌染色體DNA復(fù)性較慢，會形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA 。
質(zhì)粒提取的成功與否，直接關(guān)系到后續(xù)實驗的順利進行。因此，在整個過程中，需要嚴格遵守實驗規(guī)范，確保每一步操作都準確無誤。同時，他們還需要具備豐富的實驗經(jīng)驗和敏銳的觀察力，以便及時發(fā)現(xiàn)并解決可能出現(xiàn)的問題。
總之，質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)研究中的一項關(guān)鍵技術(shù)，它不僅能夠為科研工作者提供寶貴的實驗材料，還能夠推動基因工程等領(lǐng)域的發(fā)展。隨著生物技術(shù)的不斷進步，質(zhì)粒提取技術(shù)也將不斷完善和優(yōu)化，為科學(xué)研究提供更加可靠和高效的支持。
1、堿裂解法
原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學(xué)。
結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細菌蛋白質(zhì)、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
2、煮沸法裂解
將細菌懸浮于含Triton X-100
和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結(jié)構(gòu)，當溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
煮沸裂解法：
對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質(zhì)粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法
由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機械力質(zhì)粒DNA會變性，機械力消失后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性快，仍溶于溶液而細菌染色體DNA復(fù)性較慢，會形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA 。
質(zhì)粒提取的成功與否，直接關(guān)系到后續(xù)實驗的順利進行。因此，在整個過程中，需要嚴格遵守實驗規(guī)范，確保每一步操作都準確無誤。同時，他們還需要具備豐富的實驗經(jīng)驗和敏銳的觀察力，以便及時發(fā)現(xiàn)并解決可能出現(xiàn)的問題。
總之，質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)研究中的一項關(guān)鍵技術(shù)，它不僅能夠為科研工作者提供寶貴的實驗材料，還能夠推動基因工程等領(lǐng)域的發(fā)展。隨著生物技術(shù)的不斷進步，質(zhì)粒提取技術(shù)也將不斷完善和優(yōu)化，為科學(xué)研究提供更加可靠和高效的支持。
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