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逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術要素篩選指導

瀏覽次數:157 發布日期:2024-5-21  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。

該技術主要用于:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

一、反轉錄酶的選擇

1、Money 鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性,RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。

2、禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。

3、Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶:在Mn2+存在下,允許高溫反轉錄RNA,以消除RNA模板的二級結構。

4、MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體:商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA,這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

二、合成cDNA引物的選擇

1、隨機六聚體引物:當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時,可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時,體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板,PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

2、Oligo(dT):是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物與其配對,僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。

3、特異性引物:最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物,若PCR反應用二種特異性引物,第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA,導致更為特異的PCR擴增。 逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。

該技術主要用于:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。
來源:上海邦景實業有限公司
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