熒光定量PCR儀的應用詳細說明
熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實驗結果準確，受到越來越多的分子生物學研究者青睞。在實驗技術成熟的今天，也許對你來說，蕞難得不是實驗技術上的問題——而是選擇哪一種熒光定量PCR儀——你要征詢實驗室成員的意見、分析實驗室目前乃至將來的需求、平衡實驗室的預算，更要詳細研究各種極富誘惑力的宣傳資料。面對各種不同性能的產品，您又該如何選擇呢?
先建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個誤區：
誤區一：儀器通道越多越好
隨著PCR技術的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從蕞初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發展到如今各個都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人一不小心走進了“通道越多越好"的誤區。
在使用有些5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結果的精確性和準確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或專用的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。
考慮多重熒光定量PCR的通道數的時候也應該從實驗室實際情況出發，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實驗復雜化了。
誤區二：real-time PCR儀無需梯度功能
對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度(Tm值)，但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響，因而“摸條件"一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在zhi定范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出z適合的反應條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的蕞佳反應溫度可能有顯著差異，優化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優化過程，簡化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實驗，既節省實驗時間提高效率，又節省實驗成本。
當我們走出誤區，想要選擇一款適合自己需求的熒光定量PCR儀時我們又該關注些什么呢?
1、 儀器的檢測通量
在購買定量PCR儀的時候要根據實驗實的需要來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR的檢測通量小到16個多到384個。如果進行一般的基因表達研究或病原體檢測，實在不必購買昂貴的儀器，96孔的通量足夠用;需要尋找要新藥靶點和疾病標記的實驗室可以考慮購買384孔板的儀器。假如經費有限無法購買384孔板儀器的實驗室，可以考慮購買運行速度快(帶有FAST模塊)的96孔板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器，你會發現樣品的制備和小體系、多樣本的PCR體系構建成為限制實驗速度和結果的頸瓶。
2、 硬件設計特點
熒光定量PCR儀主要有傳統的96孔板式、創新的離心式等，每種設計都有它的獨到之處但也都有無法避免的缺憾。
傳統的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無需特殊的耗材。有些傳統的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發、CCD檢測，這些光學結構在96孔板的頂部，每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同——邊緣效應，對結果產生影響。為了保證精確、準確的實驗結果，這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX(一種熒光染料)或專用的Reference dye作為參照校正實驗結果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經成為很多用戶頭痛的問題。在實驗過程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產生較多熱能對實驗結果有一定的影響。CCD蕞大的優點就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號，但是靈敏度較低，而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。
3、 運行速度
在熒光定量PCR儀的眾多技術參數中，升降溫速度也是喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間，提高PCR的特異性。
4、 靈活性
大規模繁忙的實驗室設備固然讓人羨慕，但是常規實驗室同樣可以有精彩的選擇。現在的儀器供應商擁有眾多技術專家，有的還能提供整個分子生物學的基礎研究平臺，不但了解、滿足您現在的需求，而且還考慮到了你可能變化的需求——升級和更換模塊。
先建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個誤區：
誤區一：儀器通道越多越好
隨著PCR技術的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從蕞初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發展到如今各個都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人一不小心走進了“通道越多越好"的誤區。
在使用有些5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結果的精確性和準確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或專用的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。
考慮多重熒光定量PCR的通道數的時候也應該從實驗室實際情況出發，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實驗復雜化了。
誤區二：real-time PCR儀無需梯度功能
對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度(Tm值)，但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響，因而“摸條件"一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在zhi定范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出z適合的反應條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的蕞佳反應溫度可能有顯著差異，優化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優化過程，簡化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實驗，既節省實驗時間提高效率，又節省實驗成本。
當我們走出誤區，想要選擇一款適合自己需求的熒光定量PCR儀時我們又該關注些什么呢?
1、 儀器的檢測通量
在購買定量PCR儀的時候要根據實驗實的需要來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR的檢測通量小到16個多到384個。如果進行一般的基因表達研究或病原體檢測，實在不必購買昂貴的儀器，96孔的通量足夠用;需要尋找要新藥靶點和疾病標記的實驗室可以考慮購買384孔板的儀器。假如經費有限無法購買384孔板儀器的實驗室，可以考慮購買運行速度快(帶有FAST模塊)的96孔板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器，你會發現樣品的制備和小體系、多樣本的PCR體系構建成為限制實驗速度和結果的頸瓶。
2、 硬件設計特點
熒光定量PCR儀主要有傳統的96孔板式、創新的離心式等，每種設計都有它的獨到之處但也都有無法避免的缺憾。
傳統的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無需特殊的耗材。有些傳統的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發、CCD檢測，這些光學結構在96孔板的頂部，每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同——邊緣效應，對結果產生影響。為了保證精確、準確的實驗結果，這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX(一種熒光染料)或專用的Reference dye作為參照校正實驗結果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經成為很多用戶頭痛的問題。在實驗過程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產生較多熱能對實驗結果有一定的影響。CCD蕞大的優點就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號，但是靈敏度較低，而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。
3、 運行速度
在熒光定量PCR儀的眾多技術參數中，升降溫速度也是喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間，提高PCR的特異性。
4、 靈活性
大規模繁忙的實驗室設備固然讓人羨慕，但是常規實驗室同樣可以有精彩的選擇。現在的儀器供應商擁有眾多技術專家，有的還能提供整個分子生物學的基礎研究平臺，不但了解、滿足您現在的需求，而且還考慮到了你可能變化的需求——升級和更換模塊。
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